基因StLTPa及其编码蛋白在马铃薯抗病性中的应用

本发明属于基因工程，涉及 stltpa基因在植物抗病性中的应用，具体涉及基因 stltpa及其编码蛋白在马铃薯抗病性中的应用。

背景技术：

1、马铃薯为茄科茄属，是重要的粮蔬兼用作物。马铃薯易感染真菌病、细菌病和病毒病等病害，其中真菌病包括：晚疫病、疮痂病以及早疫病等，由致病疫霉菌（ phytophthora  infestans）引起的马铃薯晚疫病（ potato late blight）是一种严重威胁马铃薯健康生长和其产业发展的毁灭性病害，具有侵染次数频繁、发病范围广，且潜育期较短的特点。由灰霉菌（ botrytis cinerea）引起的灰霉病以及由黑胫病菌（ pectobacterium carotovorum  subsp. brasiliense）引起的黑胫病对马铃薯的生长也有较大的威胁。

2、在植物和微生物互作过程中，为了能够适应环境变化，植物体内协同进化出多层次的防御机制，植物体内在感知外界刺激后，会诱导基础防卫反应，包括病程相关蛋白（ pathogenesis related proteins，prs）的快速诱导、细胞壁加厚、胼胝质、蛋白酶抑制剂和抗菌素的累积以及活性氧的产生。pr蛋白家族具有广泛且重要的生物学功能，部分pr蛋白具有葡聚糖苷酶、过氧化物酶、核酸酶、草酸氧化酶、蛋白酶抑制剂等活性，在植物抵御外界不良环境中发挥着非常重要的作用。植物非特异性脂转运蛋白（ non-specific lipid  transfer protein，nsltps）属于pr14家族蛋白，是一类重要的生物活性物质，在调节植物生长发育、信号转导、响应逆境胁迫过程中具有重要的作用。此外，nsltps能够响应病原菌诱导表达，并对不同类型病原菌具有广谱抗性，且可以诱导植物免疫应答的发生。

3、目前对于马铃薯晚疫病的防治方法主要为化学药剂防治。目前生产上对于晚疫病的防控高度依赖化学农药，但伴随着病原菌抗药性的产生、植物与病原微生物协同进化、以及有效抗病资源有限、抗病品种培育难度较大等问题的出现，以及晚疫病菌毒性变异频繁，使得品种抗病性丧失问题突出，故从分子水平挖掘马铃薯的抗病基因，并解析它们的调控机制，进而培育广谱性抗病品种具有重要的意义。目前关于抗马铃薯晚疫病的种质资源非常有限，而且马铃薯存在种间杂交障碍，使得马铃薯抗病育种困难，马铃薯抗病品种会因为病菌的生理小种改变而丧失使用价值，造成抗病品种的使用年限受限。因此培育具有广谱性、持久抗病性的马铃薯品种有重要意义。

技术实现思路

1、为防治马铃薯晚疫病并减少化学药剂使用导致的各类问题，本发明提出基因 stltpa及其编码蛋白在马铃薯抗病性中的应用。通过挖掘在致病疫霉菌入侵马铃薯的防御反应中起正调控作用的抗病基因，并开展基因功能研究，成功克隆出一种编码脂质转运蛋白的基因 stltpa。本发明丰富了马铃薯抗病基因资源，为利用该抗病基因创制马铃薯抗病材料防控马铃薯晚疫病提供新路径。

2、为实现本发明的技术目的，一方面，本发明提供基因 stltpa在马铃薯抗病中的应用，基因 stltpa的全长开放阅读框序列如seq id no.1所示，过表达 stltpa基因能够提高马铃薯对真菌性病害的抗性， stltpa基因在马铃薯中受致病疫霉菌侵染后上调表达。

3、进一步，本发明从致病疫霉菌pi14-3-gfp诱导的本氏烟草胞间液蛋白中鉴定及茄科数据库（https://solgenomics.net/）比对到三个马铃薯脂质转运蛋白，以被致病疫霉菌侵染马铃薯叶片的rna反转录得到的cdna作为模板对其进行克隆，并利用农杆菌介导的瞬时表达系统和离体叶片接种技术鉴定到一个抗性较强的抗病基因 stltpa，所述基因 stltpa编码的脂质转运蛋白其氨基酸序列由茄科数据库获得，所述氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、进一步，本发明通过提取马铃薯叶片的rna反转录后得到cdna，经过茄科数据库获取编码脂质转运蛋白的 stltpa基因编码区（cds）完整序列，pcr扩增后得到含有 stltpa基因全长编码框的dna片段，经过双酶切反应以及大肠杆菌感受态细胞克隆后，提取质粒测序，得到编码马铃薯脂质转运蛋白的基因 stltpa的全长开放阅读框序列如seq id no.1所示。

5、进一步，本发明检测了 stltpa基因在致病疫霉菌侵染下的表达模式，得知所述基因 stltpa受致病疫霉菌侵染诱导表达。本发明提供了 stltpa基因过表达的转基因马铃薯的培育并且验证了在马铃薯中过表达 stltpa基因能够显著提高马铃薯对晚疫病、灰霉病以及黑胫病的抗性，利用 stltpa基因能够改良植物的抗病性状，培育出抗病转基因植物新品种。

6、进一步，本发明将重组质粒转化农杆菌，采用农杆菌介导法将 stltpa基因过表达载体导入到转化材料中，经过诱导愈伤组织、利用卡纳霉素抗性筛选愈伤组织、芽分化、生根等步骤最终获得马铃薯转基因植株，实现所述基因 stltpa在马铃薯植株体内的过表达。经pcr鉴定以及逆转录pcr（rt-pcr）可知， stltpa基因被成功的转入到马铃薯材料中，并且产生了相对野生型更高的 stltpa转录表达量，提高马铃薯植株对外源病菌的防御能力。

7、进一步，本发明通过对过表达 stltpa基因的转基因马铃薯进行抗病性鉴定得知，过表达 stltpa基因能够提高马铃薯植株对引起马铃薯晚疫病的致病疫霉菌（ phytophthora  infestans）、引起灰霉病的病原菌灰霉菌（ botrytis cinerea）和引起黑胫病的黑胫病菌（ pectobacterium carotovorum）的抗性。获得具有广谱抗病性的马铃薯种质材料。

8、另一方面，本发明请求保护抑菌蛋白在植物体抑菌方面的应用，抑菌蛋白由 stltpa基因编码， stltpa基因全长开放阅读框序列如seq id no.1所示， stltpa基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，抑菌蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示；抑菌蛋白在植物体中能够抑制致病疫霉菌、灰霉菌的孢子萌发以及黑胫病菌的生长发育。

9、进一步，本发明发现stltpa为病程相关类抑菌蛋白，利用大肠杆菌原核表达系统获得了stltpa蛋白，所述stltpa纯化蛋白序列如seq id no.3所示。经过验证得知脂质转运蛋白stltpa可显著抑制致病疫霉菌和灰霉菌的孢子萌发，并且抑制黑胫病菌的生长。

10、进一步，本发明检测了脂质转运蛋白stltpa在本氏烟草上对致病疫霉菌和灰霉菌的防效试验，得知脂质转运蛋白stltpa接种与本氏烟草植株后，所述植株对于致病疫霉菌和灰霉菌侵染寄主的能力有显著防治的效果。

11、还有，本发明请求保护过表达 stltpa基因在马铃薯抗病种质资源材料的选育和创制中的应用。

12、与现有技术相比，本发明提供的技术方案至少具备下述的有益效果或优点：

13、本发明通过基因工程鉴定及导入抗病相关基因来提高植物抗性，与传统抗病育种技术相比，可以突破种间生殖障碍和远缘杂交不亲合性，在较短的时间内可以实现目标性状的定向改良，为农作物提供更广谱，持久的保护。本发明通过基因功能研究，发现马铃薯脂质转运蛋白在致病疫霉菌入侵马铃薯的防御反应中起正调控作用，即 stltpa基因的过表达能够提高马铃薯抗晚疫病、灰霉病、黑胫病的能力。使其具有广谱抗病性。

14、本发明利用原核表达系统在体外获得stltpa蛋白，同时发现所述基因 stltpa编码的脂质转运蛋白为病程相关类抑菌蛋白，当浓度为5um时即可有效抑制致病疫霉菌以及灰霉菌的孢子萌发，能够显著抑制黑胫病菌的生长。本发明还发现了stltpa在防治马铃薯晚疫病、灰霉病等植物病原真菌的新用途，表明stltpa作为一种抗菌肽具有较好的广谱性。