一种非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法

本发明涉及病原菌多重检测，尤其涉及一种非特异crrna的crispr/cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法。

背景技术：

1、近年来，crispr/cas系统的兴起给新一代快速核酸检测带来了新思路，如sherlock(cas13a)、detectr(cas12 or cas14)以及holmes(cas12)等。cpf1-lamp系统是一种基于crispr/cas12a和环介导等温扩增技术(lamp)的病原菌检测体系。cpf1-lamp系统是一种基于crispr/cas12a和环介导等温扩增技术(lamp)的病原菌检测体系。由于crrna的高度特异识别，crispr/cas12a系统会对等温扩增产物进一步进行确认，并通过反式切割活性的激活将识别结果释放。便携式荧光阅读器或者侧向流动试纸条便可以实现不依赖昂贵仪器下完成对crispr/cas12a系统释放信号的完美捕捉。也正因为lamp和crispr/cas12a系统的双重特异识别，cpf1-lamp具有很好的特异性，但这也让它很难实现高通量的多重检测。此外，传统的cpf1-lamp检测理念是根据不同的靶标基因序列来设计不同的crrna，因此要想采用传统的cpf1-lamp检测方法实现对多种病原菌的检测，就需要在检测不同的病原菌时重复设计crrna。

2、田间病害致病菌复杂多样，单一的靶标基因的精准识别无法反应田间病害的复杂情况。例如，甘蔗病害不仅种类繁多，致病菌更是复杂多样，常规检测针对单一的靶标很难对甘蔗病害做出准确的判断，多重靶标识别在甘蔗病害高通量检测中愈加重要。

3、因此，有必要提供一种病原菌多重、快速可视化检测技术。

技术实现思路

1、本发明提供了一种甘蔗病原菌多重、快速可视化检测技术(cas-mcflamp)用于准确检测甘蔗梢腐病。cas-mcflamp摆脱了crispr/cas12a系统对高度特异的crrna的依赖，实现了多重可视化检测。此外，因其高灵敏度、高特异性和简易的操作流程降低了crispr/cas12a系统在田间检测中的运行时间和成本，提高了甘蔗病原菌检测效率。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种非特异crrna的crispr/cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法，包括如下步骤：

4、(1)选择能够特异性扩增单一病原菌的特异性lamp引物组；

5、(2)用lamp引物标记序列分别标记每一种病原菌的lamp引物组中的fip引物，得到每一种病原菌的lamp标记引物组；

6、(3)将每一种病原菌的lamp标记引物组混合，用于lamp多重扩增；

7、(4)对lamp多重扩增的产物进行非特异crrna的crispr/cas12a切割，释放荧光报告信号；

8、(5)通过检测释放的荧光报告信息判定是否存在病原菌。

9、优选的，所述lamp引物标记序列的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述lamp引物标记序列标记于所述fip引物的f1c区域和f2区域之间。

10、优选的，在步骤(4)释放的荧光报告信号体系中加入单链报告探针，借助交免疫胶体金试纸条实现可视化检测。

11、本发明还提供了一种基于所述检测方法的试剂盒，所述试剂盒包括核酸提取试剂盒、lamp标记引物组预混液、lbcas12a-crrna预混液、保温装置、移液器、hybri detect缓冲液和免疫胶体金试纸条。

12、本发明还提供了一种利用所述试剂盒的多重病原菌的检测方法，包括如下步骤：

13、(1)用核酸提取试剂盒提取待测样品的基因组dna；

14、(2)将所述基因组dna与lamp标记引物组预混液混合进行lamp扩增；

15、(3)在步骤(2)扩增结束后的产物加入lbcas12a-crrna预混液进行crispr/cas12a体外切割反应，释放荧光报告信号，然后加入hybri detect缓冲液，插入免疫胶体金试纸条进行可视化检测。

16、优选的，所述保温装置为可变温加热保温杯；所述移液器是在注射器的前端固定安装一个微量吸头得到的。

17、本发明还提供了一种所述的检测方法中用到的lamp引物标记序列或lamp标记引物组，所述lamp引物标记序列的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述lamp引物标记序列标记于所述fip引物的f1c区域和f2区域之间。

18、本发明还提供了一种利用所述的lamp引物标记序列或lamp标记引物组进行病原菌多重检测的应用。

19、本发明还提供了一种所述的检测方法，或所述的试剂盒，或利用所述试剂盒的多重病原菌的检测方法，或所述的lamp引物标记序列或lamp标记引物组用于检测甘蔗病原菌的应用。

20、优选的，所述甘蔗病原菌包括甘蔗梢腐病原菌、甘蔗黑穗病原菌、甘蔗白条病原菌、甘蔗赤腐病原菌中一种或几种。

21、本发明建立了一种非特异crrna的crispr/cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法，将其命名为cas-mcflamp系统。本发明提供的cas-mcflamp系统解除了传统cpf1-lamp技术对crrna的高度依赖，实现了非特异crrna的的多重可视化检测。其检测原理源自lamp的茎环结构。具体如下：

22、lamp常规的茎环形成过程中，4条基础引物(fip、f3、bip、b3)分别识别靶标序列中的6个特异区域(f3c、f2c、f1c、b1c、b2c、b3c)(图1b)。在65℃的反应体系中，模板dna处在动态平衡的状态，任何一个引物向双链dna的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离变为单链。fip引物的f2区段最先与模板dna互补序列配对，在bst dna聚合酶的作用下延伸合成互补链(图1c)。接下来f3引物与f3c序列互补，在bst dna聚合酶的作用下，一边置换之前fip引物合成的dna链，一边延伸合成与模板链完全互补的dna。由fip引物合成且被置换下来的单链dna由于其5端存在互补的f1c和f1区段，于是发生自我碱基配对，形成茎环结构(图1d)。lamp内引物(fip、bip)的构造是茎环形成的关键，常规的内引物fip由两个引物区段决定(f1c和f2)(图1a)，本发明在f1c和f2中间添加一段标记序列(图1e)，该标记序列与crrna识别的序列一致(标记序列和crrna序列设计原则:一、标记序列和crrna序列保持一致。二、此序列不能在靶标序列中找到匹配序列，即对于靶标序列而言，标记序列必须是外源的、自己不含有的。)。当被标记的lamp引物组完成lamp反应扩增时，得到的lamp产物茎环中将携带标记序列(图1h)，这意味着可以通过改变fip引物实现对不同靶标基因的共同标记。

23、因此，本发明提供cas-mcflamp系统在单一病害检测中，通过一次反应便可以检测多重致病菌，在多种病害检测中，无需重新制备特异的crrna，仅需更换lamp引物便可以实现多种病害的检测。本发明提供的cas-mcflamp系统的最低检测浓度低至30copies/μl。本发明crrna的设计标准并没有严格的标准，只要这个序列在靶标中不存在即可。

24、本发明还以甘蔗病害为例验证了其实用性。结果表明，其高度的特异性分别在甘蔗黑穗病、甘蔗白条病、甘蔗赤腐病的检测中得到了验证。

25、此外，本发明还构建了田间检测体系，无需专业的技术人员和昂贵的设备器械，便可以实现甘蔗病原菌的田间可视化检测。因其高灵敏度、高特异性和简易的操作流程降低了传统crispr/cas12a系统在田间检测中的运行时间和成本，提高了原菌检测效率。