一种固定化氨肽酶及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物工程，具体涉及一种固定化氨肽酶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、l-肌肽是由β-丙氨酸与l-组氨酸缩合生成的一种天然二肽化合物，具有抗氧化、抗衰老、预防溃疡等重要的生理、药理功能，在医药、化妆品和保健食品领域具有非常广泛的应用。

2、氨肽酶可以催化β-丙氨酸酯或β-丙氨酰胺与l-组氨酸反应生成l-肌肽，合成路线简洁、条件温和，不需要使用有害试剂，绿色环保，将可能取代传统的化学法合成工艺。目前报道的氨肽酶法合成l-肌肽大多使用游离酶或者细胞，导致催化剂难以重复使用，因此需要开发简易、高效的酶固定化技术，制备高活性与稳定性的固定化氨肽酶制剂，这对于肌肽生产过程的稳定化和连续化是非常重要的。

技术实现思路

1、基于现有技术中固定化氨肽酶合成方法复杂的问题，本发明提供一种固定化氨肽酶及其制备方法与应用。

2、本发明以交联葡聚糖凝胶作为氨肽酶固定化的载体，交联葡聚糖凝胶表面有丰富的邻位二羟基，高碘酸钠可氧化邻位二羟基，生成醛基，进而醛基可与蛋白质表面的氨基等活性基团反应，生成共价键，从而实现蛋白质或酶的固定化。

3、本发明首先提供一种固定化氨肽酶的制备方法，包括如下步骤：

4、(1)将充分溶胀的交联葡聚糖凝胶悬浮于水中，加入高碘酸钠进行氧化，生成带有表面醛基的交联葡聚糖凝胶，充分洗涤、滤干；

5、(2)将步骤(1)中获得的带有表面醛基的交联葡聚糖凝胶加入到含有氨肽酶的溶液中，充分搅拌混合；

6、(3)收集步骤(2)中上载氨肽酶的交联葡聚糖凝胶，充分洗涤、滤干，即可获得固定化氨肽酶。

7、在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，将交联葡聚糖凝胶悬浮于水中，交联葡聚糖凝胶的加载量为10～200g/l。

8、在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，加入高碘酸钠进行氧化，高碘酸钠与交联葡聚糖凝胶的质量比为1:10～1:100，反应温度为20～50℃，反应温度为反应时间为1～12h。

9、在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述交联葡聚糖凝胶选择交联葡聚糖凝胶lh-60。

10、在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，交联葡聚糖凝胶与酶液中蛋白质的质量比为40:1～5:1。

11、本发明进一步提供基于上述制备方法得到的固定化氨肽酶。

12、本发明进一步提供基于上述制备方法得到的固定化氨肽酶的应用，所述固定化氨肽酶用于催化β-丙氨酸酯或β-丙氨酰胺和l-组氨酸缩合，生成l-肌肽。

13、在本发明的一个实施方式中，所述固定化氨肽酶催化β-丙氨酸酯或β-丙氨酰胺和l-组氨酸缩合，生成l-肌肽的反应可以在搅拌釜反应器或填充床反应器中进行。

14、在本发明的一个实施方式中，所述β-丙氨酸酯选自β-丙氨酸甲酯或β-丙氨酸乙酯。

15、在本发明的一个实施方式中，所述固定化氨肽酶用于催化β-丙氨酸酯或β-丙氨酰胺和l-组氨酸缩合时，l-组氨酸与β-丙氨酸酯或β-丙氨酰胺的重量比为1:1。

16、本发明中，以交联葡聚糖凝胶作为酶固定化的载体，应用高碘酸钠对交联葡聚糖凝胶进行氧化，生成表面带有醛基的交联葡聚糖凝胶，洗涤后加入酶液中，搅拌反应一定时间，收集上载氨肽酶的交联葡聚糖凝胶颗粒。获得的固定化氨肽酶可应用于搅拌反应器或填充床反应器。本发明所述固定化方法简便易行，所得固定化氨肽酶具有较高的活性和稳定性，易于重复使用，有更好的工业应用前景。

17、本发明使用高碘酸钠氧化的方法对交联葡聚糖凝胶进行表面修饰，产生可对蛋白质分子的游离氨基进行共价固定化的醛基，从而便于实现氨肽酶的温和共价固定化，制备获得稳定的固定化氨肽酶制剂，解决了氨肽酶重复使用的问题。该制备过程条件温和，催化剂活力损失小，得到的固定化肌肽水解酶催化剂具有活性高、易于重复使用等优点，可以在搅拌釜反应器或填充床反应器中高效、稳定地催化反应。

技术特征：

1.一种固定化氨肽酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的固定化氨肽酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将交联葡聚糖凝胶悬浮于水中，交联葡聚糖凝胶的加载量为10～200g/l。

3.如权利要求1所述的固定化氨肽酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，加入高碘酸钠进行氧化，高碘酸钠与交联葡聚糖凝胶的质量比为1:10～1:100。

4.如权利要求1所述的固定化氨肽酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，进行氧化反应的温度为20～50℃，反应温度为反应时间为1～12h。

5.如权利要求1所述的固定化氨肽酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述交联葡聚糖凝胶选择交联葡聚糖凝胶lh-60。

6.如权利要求1所述的氨肽酶的固定化方法，其特征在于，步骤(2)中，交联葡聚糖凝胶与酶液中蛋白质的质量比为40:1～5:1。

7.基于权利要求1-6中任一项所述制备方法得到的固定化氨肽酶。

8.如权利要求7所述固定化氨肽酶的应用，其特征在于，所述固定化氨肽酶催化β-丙氨酸酯或β-丙氨酰胺和l-组氨酸缩合，生成l-肌肽。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固定化氨肽酶催化生成l-肌肽的反应在搅拌釜反应器或填充床反应器中进行。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述β-丙氨酸酯选自β-丙氨酸甲酯或β-丙氨酸乙酯；

技术总结
本发明涉及一种固定化氨肽酶及其制备方法与应用。本发明中，以交联葡聚糖凝胶作为酶固定化的载体，应用高碘酸钠对交联葡聚糖凝胶进行氧化，生成表面带有醛基的交联葡聚糖凝胶，洗涤后加入酶液中，搅拌反应一定时间，收集上载氨肽酶的交联葡聚糖凝胶，充分洗涤，滤干，获得固定化氨肽酶。获得的固定化氨肽酶可应用于搅拌反应器或填充床反应器。本发明所述固定化方法简便易行，所得固定化氨肽酶具有较高的活性和稳定性，易于重复使用，有更好的工业应用前景。

技术研发人员：张仙,钱小龙,林存钊,张雄寅,游智能
受保护的技术使用者：上海百福安生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15