一种提高青蒿中青蒿素含量的方法

本发明属于生物技术，涉及一种提高青蒿中青蒿素含量的方法。

背景技术：

1、青蒿素(artemisinin)作为一种有效的抗疟药物已经得到全世界的认同。目前，青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取。artemisia annua l.(青蒿)又名黄花蒿，是一年生草本药用植物。由于青蒿中青蒿素的含量非常低(占干重的0.01％-1％)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。虽然现在已经能够通过化学合成或生物合成的方式生产青蒿素，但由于难度大，产量低，成本高，不具备商业化生产的可行性。

2、目前，利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素是一种很有吸引力的方法。然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性不高。

3、利用基因工程技术获得稳定的青蒿素含量较高的青蒿新品种是一种比较可行的方法，包括采用过量表达青蒿合成途径中的关键酶法尼基焦磷酸合酶(farnesyldiphosphate synthase，fps)的方法等，如cn106755060a公开共转fps和dbr2基因提高青蒿素含量的方法及制备的青蒿，将法尼基焦磷酸合酶fps基因和青蒿醛δ11(13)双键还原酶dbr2基因共转化青蒿。通过高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的3.36倍。

4、综上所述，开发提高青蒿素产量的方法，扩展高效生产青蒿素的手段，对于青蒿素的推广应用具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，本发明首次采用抑制aamybtl3基因表达的策略提高青蒿中青蒿素的含量，为高效生产青蒿素提供新手段和思路。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，所述方法包括：

4、将青蒿遗传改造为缺乏功能性aamybtl3蛋白。

5、本发明中，发现采用如rna干扰或基因敲除等手段抑制青蒿中aamybtl3基因表达水平，能够提高青蒿素含量，为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一条可行的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素奠定坚实的基础。

6、优选地，所述遗传改造为缺乏功能性aamybtl3蛋白包括敲除aamybtl3基因或弱化aamybtl3基因表达量。

7、优选地，所述敲除aamybtl3基因的方法包括：

8、从青蒿中克隆aamybtl3基因片段，构建含aamybtl3基因靶点的把aamybtl3基因部分序列构建于cas9载体上，得到含aamybtl3基因靶点的cas9-aamybtl3植物表达载体cas9-aamybtl3，将cas9-aamybtl3载导入青蒿中获得再生植株。

9、优选地，所述敲除aamybtl3基因的方法具体包括：

10、从青蒿中克隆aamybtl3基因片段，设计sgrna，并把aamybtl3基因部分序列构建于cas9载体(市场有公开出售的生物材料)上，得到含aamybtl3基因靶点的植物表达载体cas9-aamybtl3，将cas9-aamybtl3载导入青蒿中获得再生植株。

11、优选地，所述cas9包括cas9-1300载体。

12、优选地，所述弱化aamybtl3基因表达量的方法包括：

13、从青蒿中克隆aamybtl3基因片段，构建含aamybtl3 hairpin的植物表达载体phellsgate-aamybtl3，将phellsga4te-aamybtl3导入青蒿中获得再生植株。

14、优选地，所述弱化aamybtl3基因表达量的方法具体包括：

15、从青蒿中克隆aamybtl3基因片段，把aamybtl3基因片段构建成hairpin结构后可操作性地连于表达调控序列，重组到phellsgate12载体(为市场有公开出售的生物材料，可以从多家公司如澳大利亚cambia公司购得)上得到含aamybtl3 hairpin基因的植物表达载体phellsgate-aamybtl3，将phellsgate-aamybtl3导入青蒿中获得再生植株。

16、优选地，所述提高青蒿中青蒿素含量的方法包括：

17、从青蒿中克隆aamybtl3基因片段，构建含aamybtl3 hairpin的植物表达载体phellsgate-aamybtl3和/或含aamybtl3基因靶点的cas9-aamybtl3载体，用根癌农杆菌介导，将phellsgate-aamybtl3和/或cas9-aamybtl3载体转入青蒿中获得再生植株，检测目的基因aamybtl3的整合和表达情况，测定青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

18、优选地，所述检测目的基因aamybtl3的整合和表达情况的方法包括pcr和qrt-pcr。

19、优选地，所述pcr的方法包括：

20、设计合成aamybtl3 hairpin基因的引物，进行转化植株进行dna扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性植株即为转基因青蒿植株；设计合成cas9-aamybtl3基因的引物，对转化植株进行dna扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性植株即为转基因青蒿植株。

21、优选地，所述qrt-pcr的方法包括：

22、分别设计合成aamybtl3基因和看家基因actin的引物，进行qrt-pcr扩增，利用相对定量法分析基因相对表达量，包括青蒿素合成途径关键酶ads，cyp71av1，dbr2和aldh1基因的表达等。

23、优选地，所述测定青蒿素的含量的方法包括高效液相色谱法，进一步优选地，使用zorbax sb-c183.5μm，2.1×100mm，sn861753-902，snusry002682色谱柱，流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液(65:35)，柱温为30℃，进样量为5μl，流速为0.3ml/min，单针进样时间为5min。

24、作为优选的技术方案，所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法包括以下步骤：

25、(1)从青蒿中克隆aamybtl3基因片段；

26、(2)设计sgrna，并把aamybtl3基因部分序列构建于cas9载体上，得到含aamybtl3基因靶点的植物表达载体cas9-aamybtl3，和/或，

27、把aamybtl3基因片段构建成hairpin结构后可操作性地连于表达调控序列，得到含aamybtl3 hairpin基因的植物表达载体phellsgate-aamybtl3；

28、(3)将cas9-aamybtl3和/或phellsgate-aamybtl3转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的根癌农杆菌菌株；

29、(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，利用pcr和qrt-pcr检测aamybtl3的整合和表达情况，利用荧光显微镜统计青蒿腺毛密度；

30、(5)检测转基因青蒿植株中青蒿素含量，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

31、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

32、本发明利用hairpinrna介导的rna干扰或cas9介导的基因敲除方法抑制aamybtl3的表达，实现了提高青蒿中青蒿素含量，获得了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株，phellsgate-aamybtl3转基因青蒿植株中青蒿素的含量最高可达到16mg/g dw(即干重的1.6％)，是非转化普通青蒿(9mg/g dw，即干重的0.9％)的1.8倍，cas9-aamybtl3转基因青蒿植株中青蒿素的含量最高可达到17.1mg/g dw(即干重的1.71％)，是非转化普通青蒿(9mg/g dw，即干重的0.9％)的1.9倍，为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。