一种重组菌及其在合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸中的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种重组菌及其在合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸中的应用。

背景技术：

1、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸，又称3-甲氧基-4-羟基扁桃酸、香草扁桃酸或3-甲氧基-4-羟基苯乙醇酸，是制备磺胺增效剂3，4，5-三甲氧基苄氨嘧啶(tmp)和合成香兰素的重要中间体，而香兰素作为广谱型香原料、矫味剂或定香剂，广泛用于食品、日化、烟草等行业中，需求量巨大，这也导致3-甲氧基-4-羟基扁桃酸的巨大需求量。

2、目前制备3-甲氧基-4-羟基扁桃酸的主流制备工艺为乙醛酸法，在碱性条件下，由愈创木酚和乙醛酸合成3-甲氧基-4-羟基扁桃酸。2000年，承德石油高等专科学校赵元等人发表了《3-甲氧基-4-羟基扁桃酸的合成》文章，该工艺以愈创木酚和乙醛酸为原料，反应温度25～85℃下进行缩合反应，反应时间7～8h，产品收率为48％～77％，随温度升高，产品颜色加深，粘度增大，焦油增多。国内专利cn200910242086.8、cn201711437817.5和cn202211322666.x均公开了制备3-甲氧基-4-羟基扁桃酸的方法，但是该方法的问题在于产物的选择性产出及反应混合物中产物的分离纯化，在合成过程中，除了生成目的产物外，还会生成副产物如邻对位扁桃酸、邻位扁桃酸等，使得目标产物的收率受到影响。因此有必要提供一种转化率高、产量高、副产物少、无污染的3-甲氧基-4-羟基扁桃酸合成方法。

3、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种重组菌及其在合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸中的应用，该重组菌可作为生物催化剂将底物阿魏酸转化为4-羟基-3-甲氧基扁桃酸。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的重组菌，其包含编码酪氨酸解氨酶(tal)、l-氨基酸氧化酶(aadl)和4-羟基扁桃酸合成酶(hmas)的基因；

4、其中，酪氨酸解氨酶包括notal和bctal；notal的氨基酸序列如seq id no.1所示，bctal的氨基酸序列如seq id no.2所示；

5、l-氨基酸氧化酶包括ssaadl和psaadl；ssaadl的氨基酸序列如seq id no.3所示，psaadl的氨基酸序列如seq id no.4所示；

6、4-羟基扁桃酸合成酶包括slhmas和arhmas；slhmas的氨基酸序列如seq id no.5所示，arhmas的氨基酸序列如seq id no.6所示。

7、本发明利用能够表达酪氨酸解氨酶、l-氨基酸氧化酶和4-羟基扁桃酸合成酶的重组菌作为生物催化剂，以阿魏酸和铵盐为底物制备4-羟基-3-甲氧基扁桃酸。该合成方法具体为：将底物阿魏酸和铵盐依次催化转化为4-羟基-3-甲氧基苯丙氨酸和4-羟基-3-甲氧基苯丙酮酸后再进一步转化为4-羟基-3-甲氧基扁桃酸。具体的合成路线如图1所示。

8、在一些实施例中，上述酪氨酸解氨酶notal源自nocardia otitidiscaviarum，genbank编号sua81314.1，其氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.7所示。

9、在一些实施例中，上述酪氨酸解氨酶bctal源自brevibacterium casei，genbank编号vew10663.1，其氨基酸序列如seq id no.2所示，核苷酸序列如seq id no.8所示。

10、发明人在获得酪氨酸解氨酶notal和bctal的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。

11、在一些实施例中，上述l-氨基酸氧化酶ssaadl源自streptomyces sp.，genbank编号bac55210.1，其氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.9所示。

12、在一些实施例中，上述l-氨基酸氧化酶psaadl源自paenibacillussolanacearum，genbank编号cag7643972.1，其氨基酸序列如seq id no.4所示，核苷酸序列如seq id no.10所示。

13、发明人在获得l-氨基酸氧化酶ssaadl和psaadl的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。

14、在一些实施例中，上述4-羟基扁桃酸合成酶slhmas源自streptomyces lividans，genbank编号qsj10812.1，其氨基酸序列如seq id no.5所示，核苷酸序列如seq id no.11所示。

15、在一些实施例中，上述4-羟基扁桃酸合成酶arhmas源自amycolatopsisregifaucium，genbank编号sfh61391.1，其氨基酸序列如seq id no.6所示，核苷酸序列如seq id no.12所示。

16、发明人在获得4-羟基扁桃酸合成酶slhmas和arhmas的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。

17、在一些实施例中，上述重组菌的构建方法为：将酪氨酸解氨酶、l-氨基酸氧化酶和4-羟基扁桃酸合成酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至宿主菌株中，即获得上述重组菌。

18、在一些实施例中，上述表达载体包括pcdfduet-1质粒、pacycduet-1质粒和petduet-1质粒。

19、在一些实施例中，上述重组菌的宿主为大肠杆菌。

20、在一些实施例中，上述大肠杆菌包括escherichia coli bl21(de3)、escherichiacoli dh5α、escherichia coli xl-blue。

21、本发明重组的大肠杆菌通过双质粒共表达3个酶的编码基因，可选地，pcdfduet-1装载酪氨酸解氨酶和l-氨基酸氧化酶，pacycduet-1装载4-羟基扁桃酸合成酶，然后将两个重组质粒转化到宿主菌株，得到重组菌。

22、第二方面，本发明提供了一种全细胞催化剂，其含有上述的重组菌。

23、第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码具有将阿魏酸转化为4-羟基-3-甲氧基扁桃酸功能的蛋白，上述核酸分子包括编码酪氨酸解氨酶、l-氨基酸氧化酶和4-羟基扁桃酸合成酶的基因；

24、其中酪氨酸解氨酶包括notal和bctal；notal的核苷酸序列如seq id no.7所示，bctal的核苷酸序列如seq id no.8所示；

25、l-氨基酸氧化酶包括ssaadl和psaadl；ssaadl的核苷酸序列如seq id no.9所示，psaadl的核苷酸序列如seq id no.10所示；

26、4-羟基扁桃酸合成酶包括slhmas和arhmas；slhmas的核苷酸序列如seq id no.11所示，arhmas的核苷酸序列如seq id no.12所示。

27、第四方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体携带上述核酸分子。

28、第五方面，本发明提供了含有权利要求上述核酸分子或表达载体的微生物细胞。

29、第六方面，本发明提供了上述重组菌、全细胞催化剂、核酸分子、表达载体或微生物在合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸及其下游产物中的应用。

30、第七方面，本发明提供了一种合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的方法，其包括将上述重组菌加入含阿魏酸的溶液中进行全细胞转化，获得4-羟基-3-甲氧基扁桃酸。

31、在一些实施例中，在进行全细胞转化前对重组菌进行诱导培养，该诱导培养过程为：将重组菌接种至含30-60mg/l氯霉素和30-60mg/l链霉素的lb培养基中，培养后获得种子液，然后将种子液接种至新鲜的lb培养基中，至菌浓od600nm达0.6-0.8，添加诱导剂，诱导后分离、清洗即得湿菌体。

32、在一些实施例中，上述重组菌的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm，培养时间为10-16h。

33、在一些实施例中，上述种子液的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm。

34、在一些实施例中，上述诱导条件为：诱导剂0.2-0.6mm iptg，温度为25-30℃，时间为10-16h。

35、在一些实施例中，全细胞转化的生产体系中包括：阿魏酸1-70g/l，铵盐5-30g/l，硫酸钴0.02-0.1g/l，重组菌体量1-20g/l。

36、在一些实施例中，全细胞转化的生产体系的ph为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。

37、本发明具有以下有益效果：

38、(1)本发明以阿魏酸等来源广、价格低廉的原料为底物，降低了生产成本；

39、(2)本发明重组的大肠杆菌工程菌表达双质粒三酶体系，在基因重组工艺上更为简单，且重组后的菌种筛选也较为容易，间接降低了生产成本；且本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，提高了生产效率；

40、(3)重组菌发酵工艺简单，且反应过程不产生有害物质，既不会对后续提取纯化工艺和环境造成影响，也不会导致工程菌受损，绿色环保的同时提高了生产效率；

41、(4)本发明利用重组大肠杆菌产4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的平均摩尔转化率较高，最高可达97％以上。