高效、广谱检测真菌的引物探针组合、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及真菌检测，特别涉及高效、广谱检测真菌的引物探针组合、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、医药生物技术产业正迎来蓬勃发展期，重组蛋白、干细胞类制品、基因治疗药物等生物制品的种类也趋向于多元化。由于生物材料的原材料来源广，生产流程繁琐、成品基质复杂、具有生物活性等特点，容易受到真菌等微生物的污染。

2、真菌种类庞大而多样，全世界约有150万种真菌，某些真菌在发酵工业、食品加工业、抗生素生产中具有重要作用，少数真菌为人类和动物的致病菌，其中念珠菌属、曲霉属、青霉属、链格孢属、毛孢子菌属是常见人类致病真菌。2020年版《中国药典》三部中的“无菌检查”，规定了白色念珠菌和黑曲霉为必检真菌，“生物制品生产及检定用实验动物质量控制的要求”将皮肤病原真菌(表皮癣菌属、小孢子菌属和毛癣菌属)列为唯一待检真菌。然而，《中国药典》提供的传统真菌检测方法存在操作繁琐、检测周期长等局限性，完成一次检测至少需要14天，不适用于有效期短的产品(例如减毒活疫苗、细胞治疗产品)签发，也无法对生产过程及产品进行早期风险把控，不利于企业及时采取对应措施，故针对这类产量小、效期短、终产品需要快速放行的新型生物制品。因此，建立一种高效、快速，可替代传统方法的真菌检测方法势在必行。

3、真菌具有真正的细胞核和细胞器，属于真核生物，其核糖体为80s，有大小两个亚基组成；其中，40s的小亚基含18s rrna和20多种蛋白质，60s大亚基则含有28s、5.8s、和5s三种rrna以及50多种蛋白质。真菌的18s rdna的片段较长，片段中存在保守区和可变区，选择不同的特异扩增引物将某一结构域扩增测序，可用于真菌目、科、属等分类阶元的研究。现有研究表明，真菌的高度保守区域与哺乳类动物的部分序列相似性极高，一些已公布的广谱真菌pcr引物对可扩增人基因组序列。如果待检样本中存在一定浓度的人基因组，则会显著干扰实验结果，影响检测结果的可信度。因此，设计检测病原真菌引物探针对时，除了考虑真菌种类的覆盖度，确保扩增靶点与人类全基因组的无交叉反应也显得尤为关键。

4、dna提取过程中可能出现真菌dna污染的情况，在使用通用型检测方法进行样本检测时，环境中存在的腐生型真菌，操作者携带的定植真菌，以及dna提取试剂(盒)中存在的真菌dna污染均可能导致假阳性结果，影响样本的检测和判定。此外，大多数dna试剂(盒)无法提供具体的成分组成和来源，信息的缺失让选择变得困难，也增加了去除真菌dna污染的难度。

5、现有的真菌检测技术中，例如中国专利申请cn110616253a公开了一种基于微滴式数字pcr技术的检测真菌的试剂盒及方法，该试剂盒公开了一组用于微滴式数字pcr检测真菌的引物探针组合，引物探针组合是针对真菌高度保守的18s rrna基因序列进行筛选获得的。该专利申请还公开了相应的试剂盒，其对热带念珠菌基因组dna的检出限达到3.8拷贝/μl。然而，基于现有技术中鲜有针对多种致病真菌样本处理和检测的试剂盒，文献中也缺乏相关报道。

技术实现思路

1、基于市场上鲜少有针对多种致病真菌样本处理和检测的试剂盒，文献中也缺乏相关报道，本发明提供了高效、广谱检测真菌的引物探针组合、试剂盒及其应用，通过选择真菌(例如念珠菌属、曲霉属、青霉菌、毛癣菌属、小孢癣菌属、表皮癣菌属、链格孢属、枝孢菌属等多种致病真菌)小核糖体rna基因18s基因保守区作为扩增子，在多重序列比对的基础上设计一对真菌引物探针对，可特异性的覆盖超过多种真菌，包括常见致病性真菌，如白色念珠菌、曲霉菌属(黑曲霉、巴西曲霉、烟曲霉、黄曲霉、寄生曲霉等)、青霉菌属(例如产黄青霉等)、酵母菌属(例如克鲁斯假丝酵母、热带假丝酵母、季也蒙假丝酵母等)、链格孢菌属、枝孢菌属、石膏样毛廯菌等，同时扩增子中包含真菌18s基因可变区，可结合测序技术实现对常见病原性真菌属的快速鉴定，如念珠菌属、曲霉属、青霉菌、毛癣菌属、小孢癣菌属、表皮癣菌属、链格孢属、枝孢菌属；并建立了一种灵敏度高、含内控的多种病原真菌qpcr检测方法，同时此引物探针组也充分避免了与人及其他哺乳类动物的交叉反应，使结果更真实可靠。具体通过以下技术实现。

2、高效、广谱检测真菌的引物探针组合，包括正向引物、反向引物和检测探针，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述检测探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述检测探针的5’端偶联有第一荧光基团，3’端偶联有淬灭基团。

3、正向引物(f)的核苷酸序列为：5’-tcagttatcgtttatttga-3’；

4、反向引物(r)的核苷酸序列为：5’-cgaaagttgatagggcagaa-3’；

5、检测探针的核苷酸序列为：5’-ttgaatgaaccatcgcc-3’

6、优选地，上述引物探针组合中，所述第一荧光基团为fam、tet、ned、rox、cy3、cy5、vic、joe、hex、texas red或lc red460荧光基团，所述淬灭基团为mgb、tamra、nfq、eclipse、dabcyl、bhq1或bhq2淬灭基团。

7、优选地，上述引物探针组合中，所述第一荧光基团为fam荧光基团，所述淬灭基团为mgb淬灭基团。

8、本发明还要求限定所述的引物探针组合在制备用于高效、广谱检测真菌的产品中的应用。

9、本发明还提供了用于高效、广谱检测真菌的试剂盒，包括上述的引物探针组合，还包括内控探针和内控质粒；所述内控探针的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述内控探针的5’端偶联有第二荧光基团，3’端偶联有淬灭基团；所述第二荧光基团与所述第一荧光基团不同；所述内控质粒的核苷酸序列如seq id no.5所示。内控探针的淬灭基团可以与检测探针的相同或不同。

10、作为一种优选方式，内控探针具体为：5’-hex-atcctcccaagacgcat-mgb-3’；

11、内控质粒的核苷酸序列为：

12、atgcatgtctaagtataagcaatttatacagtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagtaccttactacttggataaccgtggtaattctagagctaatacatgcttaaaatcccgactgtttggaagggatgtatttattagataaaaaatcaatgccttcgggctctttgatgattcataataacttttcgaatcgcatggccttgtgctatgcgtcttgggaggatatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagtggcctaccatggtttcaacgggtaacggggaataagggttcgattccggagagggagcctgagaaac。

13、在采用qpcr进行核酸检测时，实验人员操作误差，标本核酸提取后的抑制物残留，以及样本类型等因素均可能会影响pcr扩增的效率，使其结果存在假阴性的风险。本发明提供的上述试剂盒采用双重荧光定量pcr技术，还包含一段不会干扰靶序列扩增的片段，并将其连接至现有载体上制得人工内控质粒(internal reference control，irc)和一条内控探针。在待测样本中加入等量的内控，同时进行核酸提取和检测流程，内控的扩增曲线可用于监控样本提取丢失情况、检测体系中是否存在抑制以及操作过程中有无失误，从而避免假阴性结果，使检测结果更真实可靠。

14、作为本领域的常规技术，上述试剂盒在使用时，各试剂的用量可以为：引物探针组合的正向和反向引物各0.2μl，检测探针0.4μl，无核酸酶水2.8μl；如果还含有内控探针和内控质粒，则内控探针0.4μl，内控质粒1μl。

15、优选地，上述试剂盒还包括qpcr反应液、无模板对照、阳性对照。这些试剂与引物探针组合、内控质粒、内控探针组成完整的qpcr扩增体系。作为本领域的常规技术，上述试剂盒中，所述qpcr反应液作为现有市售的常规试剂或试剂盒产品，在本发明中，可以选用市售的2×premix ex taq 10μl。

16、优选地，上述试剂盒还包括核酸提取体系，所述核酸提取体系包括预裂解液、dna酶、溶壁酶、核酸裂解液和proteinase k。所述dna酶可以选用全能核酸酶或脱氧核糖核酸酶。所述溶壁酶和proteinase k均为商品化产品。

17、作为本领域的常规技术手段，一般情况下正向引物、反向引物、真菌检测探针、内控探针的终浓度可以选择为0.05μm-1μm，人工内控质粒的终浓度可以选择为0.5copies/μl-20copies/μl。

18、所述预裂解液包括离子去污剂，离子去污剂由十二烷基硫酸钠(sds)、脱氧胆酸钠、胆酸钠、十二烷基肌氨酸钠、np-40、triton x-100、正十二烷基麦芽糖苷(ddm)、皂苷、tween-20、tween-80中的一种或者多种组成。

19、所述核酸裂解液由10-20wt％的chelex 100和缓冲溶液组成，整个提取过程可控制在1h以内，具有样品丢失率低，污染几率小，操作简单快捷，价格低廉等优势。chelex 100是一种化学类的螯合树脂，可以保护核酸不被降解，常在法医鉴定中用于dna的提取，其生产过程中不涉及生物反应，无微生物核酸残留，提取dna具有样品丢失率低，操作简单快捷，污染几率小，价格低廉，对试剂设备的要求低等优势，适用于本真菌检测方法样本核酸提取部分。本发明使用chelex 100替代传统方法和成品试剂盒的核酸裂解液，可快速处理样本，从样本处理到qpcr检测可在6h内迅速完成，满足快速放行的需要。

20、所述无模板对照中使用nuclease-free water(无核酸酶水)，阳性对照中使用白色念珠菌基因组。

21、本发明还提供了一种不以疾病诊断和治疗为目的的高效、广谱检测真菌的方法，采用含有内控探针和内控质粒的上述试剂盒；用于定性或定量检测细胞培养上清、细胞种子库、干细胞制品和生物制品中的真菌污染。

22、优选地，上述方法具体包括以下步骤：

23、s1、取待测样品配制成供试品，将所述内控质粒加至供试品或qpcr反应液中，提取供试品中的核酸；将阳性对照基因组加入内控质粒和无核酸酶水并稀释配制成阳性对照；将内控质粒用无核酸酶水配制成无模板对照；

24、需要说明的是，本发明提供的试剂盒可以包括预裂解液、核酸裂解液、dna酶和溶壁酶等试剂(即核酸提取体系)，但至于是否使用需要视具体情况而定。具体而言在上述步骤s1中，在配制供试品之前，需要根据获取的样品类型来选择是否进行预处理过程：(1)如果无需进行样本预处理，则可以直接配制成供试品溶液进行核酸提取；(2)如果需要进行样本预处理，则预处理过程是加入适量的预裂解液(例如100-1000μl)混合均匀，加入适量的dna酶(例如0.5-10μl)涡旋均匀，离心后收集沉淀再进行后续核酸提取。

25、不论是否进行预处理，核酸提取过程都是：在供试品(或沉淀)中加入适量的核酸裂解液(例如20-100μl)、溶壁酶(例如1-5μl)，37℃温浴后，加入适量的proteinase k(例如1-5μl)，置于56℃中温浴10min，煮沸10min，冷却后高速离心，提取待测样本的核酸。

26、s2、在荧光定量pcr仪上创建第一荧光基团检测通道和第二荧光基团检测通道，对供试品、无模板对照、阳性对照分别进行qpcr反应，分别读取双通道的ct值；

27、作为本领域的常规技术，双重定量pcr扩增体系为：pcr扩增反应液15μl(qpcr反应液10μl，正向引物0.2μl，反向引物0.2μl，检测探针0.4μl，内控探针0.4μl，内控质粒1μl，无核酸酶水2.8μl)，步骤s1获得的含核酸的混合液(或无模板对照，或阳性对照)5μl，总体积为20μl；

28、作为本领域的常规技术，pcr反应扩增程序为：(1)95℃预变性，10min(2)95℃变性，15s；(3)50℃退火，30s；(4)72℃延伸，20s；第(2)-(4)步循环40次。

29、s3、针对ct值进行结果判定；

30、分别在对应的通道查看扩增情况，供试品检测扩增曲线的阈值线为所述阳性对照ct值的10％，内控质粒扩增曲线的阈值线为无模板对照中内控质粒ct值的10％；

31、当供试品的第一荧光基团检测通道ct值＜40，则判定真菌检测结果为阳性；

32、当供试品的第一荧光基团检测通道为na或者ct值≥40，供试品的第二荧光基团检测通道有正常扩增曲线并且与无模板对照中的第二荧光基团检测通道的ct值相差不超过3个循环，则判定真菌检测结果为阴性。

33、需要说明的是，上述高效、广谱检测真菌的方法中，内控质粒可以选择直接加在供试品中，即在提取供试品核酸之前就已经加入内控质粒；也可以选择在进行qpcr之前，加在qpcr反应液中，即在提取供试品核酸之后加入内控质粒。这两种内控质粒的加入方法都属于本发明的保护范围。

34、当选择将内控质粒加在qpcr反应液中时，与提取前加在供试品中的区别就在于：在配制供试品时不加入任何内控质粒，而是将定量的内控质粒和qpcr反应液混合均匀，直接配置成混合液。在需要qpcr反应前，取定量的混合液和样品模板混合均匀，随后进行qpcr反应；并且做若干个重复。

35、综上所述，本发明提供的高效广谱检测真菌的方法中，内控质粒的加入方法有多种选择。不论是加至供试品中，还是在qpcr反应前加至qpcr反应液中，上述内控质粒的加入方法都属于本发明的保护范围。

36、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

37、1、本发明提供的引物探针组合以及相应的试剂盒和检测方法，特异性强、重复性好，灵敏度高达1genome copies/μl，试剂盒灵敏度可达到5-100cfu/ml。

38、2、检测所需样本量少，检测操作简单快速，可在6h内完成从样本处理到核酸检测整个过程，优于传统真菌检测方法，其结果准确可靠；适用于干细胞快速放行检测中-真菌检测，也可监控各种细胞种子库、细胞制剂和生物制品生产过程中早期真菌污染。

39、3、本发明提供的引物探针组合具有广谱性，可覆盖多种真菌，包括白色念珠菌、曲霉菌属(黑曲霉、巴西曲霉、烟曲霉、黄曲霉、寄生曲霉等)、青霉菌属(例如产黄青霉等)、酵母菌属(例如克鲁斯假丝酵母、热带假丝酵母、季也蒙假丝酵母等)、链格孢菌属、枝孢菌属、石膏样毛廯菌等；且与亲缘性相近的物种如真核细胞(人间充质干细胞、人宫颈癌细胞hela、非洲绿猴肾细胞vero、仓鼠肾细胞bhk-21和仓鼠卵巢细胞cho-k1等)无交叉反应，样本适用范围广。

40、4、在进行外源因子污染检测时，细胞制剂和细胞种子库等样本中含有不同浓度的细胞，常常存在基质干扰等问题，会导致检测灵敏度下降，严重影响检测结果的准确性。目前，市面上同类型产品抗干扰上限为1×106cells/ml，本发明对样本核酸提取过程进行优化，允许细胞基质残留含量高达2×107cells/ml，抗杂质干扰能力强，可覆盖绝大多数细胞样本，解决了长期以来细胞基质抑制的问题。

41、5、本发明的核酸提取体系使用含有10-20wt％chelex的核酸裂解液处理样本，操作简单快捷，且样品丢失率低，具有低污染，价格低廉对试剂设备的要求低等优势。