一种用于鉴定消除核酸气溶胶污染效果的检测方法与流程

本发明涉及c12q1/00，具体涉及一种用于鉴定消除核酸气溶胶污染效果的检测方法。

背景技术：

1、当在检测环境中核酸气溶胶的含量过高时，随着核酸气溶胶的沉降，会附着在基因扩增实验室检测装置和检测者的身上，并且随着检测环境中人员流动和空气流动，易出现核酸气溶胶混合在被检测的样品中，对被检测样品产生污染效果，从而使被检测样品的检测结果出现假阳性的问题。

2、目前会采用特定波长的紫外线光照进行基因扩增实验室检测环境中核酸气溶胶的消除，但消除的效果一般；采用核酸气溶胶污染清除仪进行消除核酸气溶胶，但对于核酸气溶胶的消除效果无法进行准确的测量，对于核酸气溶胶的消除效果也不明确。专利申请号为cn202111267114.9的中国专利公开了一种消除交叉污染的闭管可视化pcr检测方法，用于消除扩增产物交叉污染，用于检测降低检测结果的假阳性率；但解决测试结果假阳性的源头在于要消除核酸气溶胶，是否能消除还需要一定的检测方法进行辅助判断。

3、因此，提供一种用于鉴定消除核酸气溶胶污染效果的检测方法是目前需要解决的主要技术问题。

技术实现思路

1、为了解决上面问题，本发明提供了一种用于鉴定消除核酸气溶胶污染效果的检测方法，包括以下步骤：

2、s1.制备核酸溶液；

3、s2.喷雾，将核酸溶液转移至气溶胶发生器中，采用气溶胶发生器对气雾室进行喷雾；

4、s3.采样，采用液体撞击式采样器采集气雾室中核酸气溶胶；

5、s4.清除核酸气溶胶，采用核酸气溶胶清除设备对气雾室进行清除核酸气溶胶；

6、s5.采样，采用液体撞击式采样器采集气雾室中核酸气溶胶；

7、s6.pcr扩增，将气溶胶清除前和清除后采样液作为模板进行pcr扩增；

8、s7.计算核酸清除率。

9、优选地，所述s1中通过从mdck细胞中提取病毒h1n1基因组dna，并以此作为模板，配制扩增体系，进行扩增制备得到核酸溶液。

10、优选地，所述配制扩增体系通过按照试剂盒中的条件进行扩增配制扩增体系。

11、优选地，所述试剂盒的阳性对照样品核酸浓度为1×107拷贝数/μl，将其十倍梯度稀释，进行pcr扩增，再将每个核酸浓度对应的log值和ct值做标准曲线。

12、所述标准曲线公式为y＝-3.4266x+35.371，r2＝0.9995。

13、所述y为ct值；所述x为核酸浓度对数(log)值。

14、所述标准曲线图见图1。

15、优选地，所述s2喷雾步骤中采用将扩增制备得到的核酸溶液加入8-15ml去离子水中混匀，调节核酸浓度为1×105-1×107拷贝数/ml，转移至气溶胶发生器。

16、进一步地，所述s2喷雾步骤中采用将扩增制备得到的核酸溶液加入10ml去离子水中混匀，调节核酸浓度为1×106拷贝数/ml，转移至气溶胶发生器。

17、为了鉴定核酸气溶胶的清除效果，发明人在实验过程中发现，初始从mdck细胞中提取的h1n1基因组dna直接用于气雾室中，会存在初始污染核酸浓度太低，不能很好鉴定核酸气溶胶清除设备对气雾室中核酸气溶胶的清除效果。通过将h1n1基因组dna进行扩增配制扩增体系，提高初始污染的核酸气溶胶的浓度，有利于鉴定核酸气溶胶清除设备对气雾室中核酸气溶胶清除效果。

18、优选地，所述s2喷雾步骤中喷核酸溶液的体积量为8-15ml。

19、进一步地，所述s2喷雾步骤中喷核酸溶液的体积量为10ml。

20、优选地，所述s2喷雾步骤中将气溶胶发生器放入温度为20-25℃、相对湿度为50-70％的15-25cm3气雾室中。

21、优选地，所述s2喷雾步骤中采用气溶胶发生器对气雾室进行喷雾过程中采用空气流动设备对气雾室内的空气进行流动4-8min；喷雾完毕后继续进行空气进行流动4-8min，而后静置4-8min。

22、进一步地，所述s2喷雾步骤中将气溶胶发生器放入温度为23℃、相对湿度为60％的20cm3气雾室中；采用气溶胶发生器对气雾室进行喷雾过程中采用空气流动设备对气雾室内的空气进行流动5min，喷雾完毕后继续进行空气进行流动5min，而后静置5min。

23、进一步地，所述空气流动设备为风扇，所述风扇可选用奥克斯(aux)吊扇，型号为奥克斯fd-120。

24、优选地，所述s3和s5中采样位置为气雾室正中央采样，距离地面1米处的位置。

25、为了客观获得气雾室中核酸气溶胶的含量，发明人在实验过程中采用气溶胶发生器对气雾室进行喷雾过程中，采用空气流动设备对气雾室内的空气进行流动4-8min；喷雾完毕后继续进行空气进行流动4-8min，而后静置4-8min；特别是s2喷雾步骤中将气溶胶发生器放入温度为23℃、相对湿度为60％的20cm3气雾室中；采用气溶胶发生器对气雾室进行喷雾过程中，采用空气流动设备对气雾室内的空气进行流动5min，喷雾完毕后继续进行空气进行流动5min，而后静置5min，并且采用风扇对气雾室中的空气进行流动可以使核酸气溶胶在气雾室中的分布均匀，并且s3和s5中采样位置为气雾室正中央采样，距离地面1米处的位置，能客观的获得采样的样品中含有的核酸气溶胶含量。

26、进一步地，所述气雾室包括对照组气雾室和试验组气雾室。

27、进一步地，同时对对照组气雾室和试验组气雾室分别用液体撞击式采样器进行核酸清除前采样，作为对照组试验开始前和试验组核酸清除处理前的阳性对照检测污染核酸量。

28、为了获得明确的核酸气溶胶的清除效果的验证，发明人在实验过程中发现，通过采用将每个浓度对应的log值和ct值做标准曲线，并且采用对照组气雾室和试验组气雾室分别进行消除核酸气溶胶，通过一定的消除作用时间后再进行采样，可以获得多因素条件下核酸气溶胶的清除效果。

29、优选地，所述s4中清除核酸气溶胶，采用核酸气溶胶清除设备对气雾室进行清除核酸气溶胶；所述对照组气雾室采用核酸气溶胶清除设备进行处理，所述核酸气溶胶清除设备中不含清除剂，开启清除设备进行分段处理，分段处理可包括只进行一次处理和进行二次处理，所述只进行一次处理的时间为25-35min；所述分段进行二次处理过程包括一次处理和二次处理，所述一次处理时间为25-35min，所述二次处理时间为25-35min；所述试验组气雾室采用核酸气溶胶清除设备进行处理，核酸气溶胶清除设备中包含清除剂，开启清除设备进行一次处理和二次处理，一次处理时间为25-35min，二次处理时间为25-35min；采用液体撞击式采样器分别对对照组气雾室和试验组气雾室经过一次处理后和二次处理后再进行采样。

30、进一步地，所述分段进行二次处理过程包括一次处理和二次处理，所述一次处理时间为30min，所述二次处理时间为30min；所述试验组气雾室采用核酸气溶胶清除设备进行处理，核酸气溶胶清除设备中包含清除剂，开启清除设备进行一次处理和二次处理，一次处理时间为30min，二次处理时间为30min；采用液体撞击式采样器分别对对照组气雾室和试验组气雾室经过一次处理后和二次处理后再进行采样。

31、发明人在实验过程中发现，当采用分段二次处理后进行采样，特别是采用一次处理和二次处理，一次处理时间为25-35min，二次处理时间为25-35min；对照组气雾室采用核酸气溶胶清除设备进行处理，但核酸气溶胶清除设备中不含清除剂，通过采用具体的实施方法步骤可以比较明确的获得处理时间和次数对气雾室中核酸气溶胶清除性效果的验证，并且对核酸气溶胶清除设备采用清除剂对气雾室中的核酸气溶胶清除性的检测效果也能获得明确的验证数据。

32、优选地，所述s6中进行pcr扩增，将气溶胶清除前和清除后采样液作为模板进行pcr扩增，再根据ct值计算采样液中对应的核酸含量。

33、优选地，所述s7中计算核酸清除率采用的计算方式如下：

34、

35、

36、nt为空气中核酸的自然消亡率；

37、v0与vt分别为对照组试验开始前和试验过程中不同时间的空气中核酸含量；

38、kt为清除处理对空气中核酸的清除率；

39、v0'与vt'分别为试验组清除处理前和清除过程中不同时间的空气中核酸含量。

40、清除前后空气中的核酸含量(拷贝数/m3)按下列公式计算：

41、

42、有益效果

43、1.本发明提供的检测方法能很好的鉴定核酸气溶胶清除设备对空气中核酸气溶胶的清除效果。

44、2.本发明中通过将h1n1基因组dna进行扩增配制扩增体系，提高初始污染的核酸气溶胶的浓度，有利于鉴定核酸气溶胶清除设备对气雾室中核酸气溶胶的清除效果。

45、3.本发明中限定采用空气流动设备的类型及采样的位置，可以客观获得气雾室中核酸气溶胶的含量。

46、4.本发明中通过采用对照组气雾室和试验组气雾室分别进行消除核酸气溶胶，通过一定的消除作用时间后再进行采样，可以获得多因素条件下核酸气溶胶的清除效果。

47、5.本发明中通过采用分段处理后进行采样，能比较明确的获得处理时间和次数对气雾室中核酸气溶胶清除性效果的验证。