一种检测牦牛PMM2基因印迹表达的引物及方法与应用

本发明涉及分子标记，具体涉及一种检测牦牛pmm2基因印迹表达的引物及方法与应用。

背景技术：

1、基因组印记是存在于哺乳动物中的一种重要的表观遗传修饰机制，与生物体胎儿发育及出生后生长密切相关。磷酸甘露糖变位酶2(phosphomannomutase 2,pmm2)基因在人的16号染色体上，该位置出现母源单亲二体性会导致新生儿发生致命的发育性肺病；在人上pmm2基因突变可引起先天性糖基化障碍与高胰岛素血症，pmm2基因与糖代谢和胰岛素功能密切相关。在黄牛上，pmm2基因位于25号染色体上，且呈现出父源印迹状态。牦牛作为青藏高原特有的畜种，经过长期的自然选择，已经获得了能够适应高海拔低氧环境的解剖学和生理学性状，已有研究发现其心肺功能发达、没有肺动脉高压、觅食能力强和能量代谢高等特点，独特的环境使牦牛肉具有优于普通黄牛肉的营养品质，如高蛋白、低脂肪、多氨基酸和不饱和脂肪酸等，而目前尚未见牦牛中pmm2基因表达的相关研究，在肺及其他组织中是否呈现出印迹表达也未见报道，其参与糖代谢和肉质调控的机制尚不清楚。

2、鉴于此，使用dna提取试剂盒(天根，北京)提取牦牛基因组dna，利用trizol试剂(invitrogen，美国)提取各组织，包括肺、心、肌肉、肾、睾丸的总rna，以dnase i去除基因组dna后反转录得到cdna。基于snp比较基因组dna和cdna扩增产物的方法分析pmm2基因在牦牛各组织中的表达状态，揭示其是否呈现出印迹表达，结果对于进一步研究其参与调控牦牛生长及发育及高海拔低氧环境适应性具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测牦牛pmm2基因印迹表达的引物及方法与应用，进一步丰富了牦牛印迹基因目录，有利于进一步研究pmm2基因调控牦牛肺部发育及糖代谢和肉质调控的分子机制。

2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：

3、一种检测牦牛pmm2基因印迹表达的引物，所述引物序列如seq id no：1～10所示。

4、另一方面，本发明提出基于上述引物进行牦牛pmm2基因印迹表达的检测方法，包括以下步骤：

5、s1：采集牦牛样本，所述样本包括但不限于血液、肺、心、肌肉、肾、睾丸，置于-80℃待用；

6、s2：提取各组织dna和总rna；

7、s3：针对dna外显子上设计的引物进行检测杂合snp位点；

8、s4：再经反转录后得到cdna，基于牦牛pmm2基因dna外显子设计的引物测序结果，以确定该基因在牦牛中的印迹状态。

9、进一步的，所述步骤s2具体为：采用饱和苯酚-氯仿法提取牦牛全基因组dna；使用trizol试剂(invitrogen，美国)提取肺、心、肌肉、肾、睾丸组织的总rna，dnase i去除基因组dna后反转录得到cdna；通过核酸蛋白仪分析dna和rna原样的浓度和纯度；

10、进一步的，所述步骤s3包括以下子步骤：

11、s3.1：根据ncbi数据库牦牛pmm2基因的参考序列，采用primer premier5.0软件设计引物，以基因组dna为模板扩增编码区序列；

12、s3.2：以牦牛基因组dna进行pcr反应，根据设计的引物进行牦牛pmm2基因扩增；

13、s3.3：pcr产物经sanger测序后对结果进行分析比对，检测pmm2基因外显子内的snp位点，确定snp位点的存在与否；

14、进一步的，所述步骤s4包括以下子步骤：

15、s4.1：以反转录的牦牛cdna为模板进行pcr反应，进行pmm2基因cdna外显子9的扩增；

16、s4.2：通过dna和cdna测序峰图对比，基于pmm2基因外显子内的snp位点分析该基因cdna上的碱基分布，以判断该基因呈双等位基因表达还是单等位基因表达，以确定该基因在牦牛中的印记状态。

17、进一步的，所述步骤s3.2具体包括：以牦牛基因组dna为模板进行pcr反应，dna模板浓度约为20ng/μl，pcr反应体系为10μl：2×taq pcr mix 5μl；ddh2o 3.2μl；上、下游引物各0.4μl；dna模板1.0μl。pcr反应程序为：95℃预变性3min，30个循环过程，94℃变性25s、选择最适退火温度53℃退火25s、72℃延伸10s，最后72℃延伸5min，pcr扩增结束后用2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物。

18、进一步的，所述步骤s3.3具体包括：将pcr检测后的产物通过abi prism3700dnaanalyzer测序，对测序结果分析比对，检测snps位点情况，结果在外显子9内一共检测到4个变异位点：g.30100a>g；g.30111c>t；g.30118c>t；g.30138g>t。

19、进一步的，所述步骤s4.1具体包括：以反转录的牦牛cdna为模板进行pcr反应，cdna模板浓度约为20ng/μl，pcr反应体系为10μl：2×taq pcr mix 5μl；ddh2o 3.2μl；上、下游引物各0.4μl；dna模板1.0μl。pcr反应程序为：95℃预变性3min，30个循环过程，94℃变性25s、选择最适退火温度53℃退火25s、72℃延伸10s，最后72℃延伸5min，pcr扩增结束后用2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物；将pcr检测后的产物通过abi prism3700dnaanalyzer测序，对测序结果分析比对。

20、进一步的，所述步骤s4.2具体包括：通过dna和cdna测序峰图对比，g.30100a>g；g.30111c>t；g.30118c>t；g.30138g>t四个snp位点处，dna为杂合子，cdna为纯合子，表明该基因在牦牛以上组织中均呈印迹表达，为印迹基因。

21、另一方面，本发明提出上述引物于牦牛基因印记表达检测的应用。

22、进一步的，所述应用包括但不限于制备牦牛基因印记表达检测试剂盒、试剂的应用。

23、进一步的，通过使用dnase i去除基因组dna，可以消除反转录过程中基因组dna的干扰。这样可以确保后续的cdna反转录过程中所得到的产物纯粹是来自rna的，避免基因组dna的干扰，保证cdna的纯度和可靠性。

24、进一步的，对于外显子序列中检测到snp位点的pmm2基因，通过dna和cdna测序结果的比对可以确定其表达状态。如果dna和cdna序列比对结果不同，说明该基因呈现出印迹表达。这对于进一步研究pmm2基因的调控机制以及与牦牛生长发育和高海拔低氧环境适应性的关系具有重要意义。

25、本发明的有益效果：

26、1.高灵敏度和特异性：通过使用snp比较基因组dna和cdna扩增产物的方法，可以对pmm2基因在牦牛各组织中的表达状态进行准确和可靠的分析。snp位点的存在可以有效区分不同基因型，从而确定基因的表达状态。这种方法具有高灵敏度和特异性，能够准确地检测出pmm2基因的表达差异。

27、2.揭示基因的印迹表达：本发明通过引物的设计和使用，可以选择性地扩增牦牛pmm2基因的外显子序列，并根据pcr产物的测序结果来推断snp位点的存在与否。通过此方法，可以确定pmm2基因在牦牛基因组dna中的snp位点，并揭示该基因在不同组织中的表达状态。这些结果有助于深入了解pmm2基因的功能和调控机制，以及与牦牛生长发育和高海拔低氧环境适应性的关系。

28、3.丰富印迹基因目录：本发明计了用于检测牦牛pmm2基因印迹表达的引物，为牦牛印迹基因的研究提供了新的工具和方法，丰富了该领域的研究内容。通过分析pmm2基因的印迹表达，可以丰富牦牛或其他相关物种的印迹基因目录。印迹基因是一类仅由父本或母本等位基因表达的基因，对于了解动物发育、适应性进化等方面具有重要意义。本技术方案可为印迹基因研究提供新的可靠方法和数据，丰富我们对印迹基因的认识。

29、4.深入研究基因功能和调控机制：pmm2基因作为一个潜在的调控基因，通过分析其在不同组织中的表达状态和印迹表达，可以更好地了解其在牦牛生长发育和适应性调节中的功能和调控机制。这对于深入研究牦牛的生物学特性，特别是其在高海拔低氧环境下的适应性具有重要的科学意义。

30、5.提取高质量的dna和rna样本：dna提取试剂盒(天根，北京)和trizol试剂(invitrogen，美国)采用先进的提取方法，能够从牦牛样本中提取高质量的基因组dna和总rna。高质量的样本是后续实验的基础，可以确保实验结果的准确性和可靠性；同时dna提取试剂盒和trizol试剂所采用的饱和苯酚-氯仿法和酚-氯仿法能够有效地去除样本中的蛋白质、杂质和抑制物，以保证提取的dna和rna的纯度。此外，这些试剂还能够保持dna和rna的完整性，避免降解和损伤。

31、综上所述，本技术方案提出的检测方法具有高灵敏度和特异性，可以揭示基因的印迹表达，丰富印迹基因目录，从而深入研究基因功能和调控机制。这对于理解牦牛的遗传特性、生长发育和适应性调节等方面具有重要的理论和实践意义。

32、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。