一种亚隔孢壳属真菌Didymellasegeticola原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法

本发明属于农业植物保护，具体涉及一种亚隔孢壳属真菌d.segeticola原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法。

背景技术：

0、技术背景

1、茶树叶斑病是由真菌引起的叶部病害，该病原菌可为害茶树新梢、嫩叶和成叶，造成病叶畸形扭曲，病叶生长发育变得缓慢，严重时整片叶脱落。该病害在倒春寒期间发病率较高，发病程度重，严重损害茶叶品质和产量，带来巨大的经济损失。本课题组通过构建多基因系统发育树结合形态学特征鉴定了d.segeticola是茶树叶斑病的优势病原菌。didymella segeticola的全基因组数据已经公布，但对该病原菌致病机制及在侵染过程中与茶树的互作机制缺乏了解。为揭示d.segeticola对茶树的侵染机制，进而防治该病害，需通过建立稳定高效的遗传转化体系，以鉴定和分析该病原菌的关键致病基因。

2、本发明旨在提供应用于d.segeticola的peg介导的原生质体转化体系，为茶树叶斑病病原菌d.segeticola致病机制的研究提供基础。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供d.segeticola原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法。该方法可制备出数量较多的原生质体，且原生质体转化效率较高。

2、为了实现上述目的本发明提供了一种亚隔孢壳属真菌d.segeticola原生质体的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)菌株活化及培养；

4、(2)菌丝的制备：将在pda培养基生长7d的菌株接种到pdb培养基中进行培养，培养后的菌丝经研磨仪研磨后，接种至yepd液体培养基中培养得到幼嫩菌丝；

5、(3)将所述菌丝与酶解液充分混合，裂解，得到原生质体。

6、优选的，步骤(1)中菌株活化及培养：将在-80℃保存的d.segeticola菌株接种到pda培养基，25℃黑暗培养5～7d。

7、优选的，步骤(2)中摇床培养条件：震荡频率为180～200rpm，温度为25～28℃，时间为2d。

8、优选的，步骤(2)中将所述菌株充分研磨，频率为60hz时间为120s，接种至yepd培养基中进行培养，得到幼嫩菌丝；所述菌丝培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为12～16h。

9、优选的，步骤(3)中酶解液包括溶剂和溶质，所述溶剂包括磷酸缓冲液，所述溶质包括纤维素酶、崩溃酶、和溶菌酶，所述裂解液培养2～7h，得到原生质体，浓度为(1.0～1.5)×107个/ml。

10、本发明还提供了一种亚隔孢壳属真菌d.segeticola遗传转化体系的构建方法，包括以下步骤：

11、采用上述技术方案所述的制备方法制备得到d.segeticola原生质体；

12、将所述d.segeticola原生质体与stc溶液混合，得到d.segeticola原生质体悬浮液；

13、将所述d.segeticola原生质体悬浮液、含有抗生素标记基因和gfp基因的质粒、肝素钠溶液混合，0～4℃静置30min，得到第一原生质体溶液；

14、向所述第一原生质体溶液中逐滴加入sptc溶液，0～4℃静置30min，得到第二原生质体溶液；

15、将所述第二原生质体溶液悬浮于再生培养基复苏，得到复苏的原生质体溶液；

16、将所述复苏的原生质体溶液与选择性培养基混合，暗培养12～14d，得到d.segeticola转化子。

17、优选的，所述d.segeticola原生质体悬浮液中原生质体的浓度为1.3×105个/μl；所述肝素钠溶液的浓度为0.1g/ml。

18、优选的，所述再生培养基以水为溶剂，包括：酵母粉1wt.％，酪蛋氨基酸1wt.％和蔗糖274wt.％；ph值为7.0；

19、所述选择性培养基以水为溶剂，包括：马铃薯汁20wt.％，葡萄糖2wt.％，琼脂1.5wt.％和与所述抗生素标记基因对应的抗生素；

20、所述yepd培养基以水为溶剂，包括：蛋白胨1wt.％，酵母膏0.3wt.％，葡萄糖1wt.％，ph自然值。

21、优选的，所述抗生素标记基因包括新霉素g418抗性表达基因。

技术特征：

1.一种亚隔孢壳属真菌d.segeticola原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)菌株活化及培养：将在-80℃保存的d.segeticola菌株接种到pda培养基，25℃黑暗培养5～7d。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)摇床培养条件：震荡频率为180～200rpm，温度为25～28℃，时间为2d。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)将所述菌丝充分研磨，频率为60hz时间为120s，接种至yepd培养基中进行培养，得到幼嫩菌丝；所述菌丝培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为12～16h。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)酶解液包括溶剂和溶质，所述溶剂包括磷酸缓冲液，所述溶质包括纤维素酶、崩溃酶和溶菌酶，所述裂解液培养2～7h，得到原生质体，浓度为(1.0～1.6)×107个/ml。

6.权利要求1～5任一项所述的制备方法应用于构建d.segeticola遗传转化体系。

7.didymella segeticola遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述d.segeticola原生质体悬浮液中原生质体的浓度为1.3×105个/μl；所述肝素钠溶液的浓度为0.1g/ml。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述再生培养基以水为溶剂，包括：酵母粉1wt.％，酪蛋氨基酸1wt.％和蔗糖274wt.％；ph值为7.0；

10.根据权利要求7或9所述的构建方法，其特征在于，所述抗生素标记基因包括新霉素g418抗性表达基因。

技术总结
本发明属于农业植物保护技术领域，公开一种亚隔孢壳属真菌Didymella segeticola原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法。本发明利用酶解液从D.segeticola菌丝中制备原生质体，获得的D.segeticola原生质体可以有效地用于构建聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)介导的原生质体转化体系。本申请提供了快速制备D.segeticola原生质体条件，找到适用D.segeticola的遗传转化体系。

技术研发人员：吕务云,张幼,王玉春,涂一怡,徐婷,蒋鸿,黄超,任恒泽,王新超
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15