肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法及其用途与流程

本技术涉及生物医药领域，具体的涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法及其用途。

背景技术：

1、使用过继性自体转移肿瘤浸润淋巴细胞治疗肿瘤是一种治疗预后不良患者的有效方法。但是过继性自体转移肿瘤浸润淋巴细胞治疗肿瘤需要大量的肿瘤浸润淋巴细胞，而且目前来自患者肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞的扩增能力弱，细胞功能不强。因此如何提供一种稳健可靠的肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法是亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本技术提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法，所述培养方法具有选自以下组的一种或多种的效果：til细胞的数量增加，til细胞的分泌能力提高，til细胞的杀伤能力提高，til细胞的比例改变，中心记忆t细胞比例增加，调节性t细胞的比例降低，活化t细胞比例增加，肿瘤特异性t细胞比例增加，和干细胞样t细胞比例增加。

2、一方面，本技术提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(til)的方法，其包括：使经扩增的til在与t细胞共刺激分子和/或t细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。

3、在一种实施方式中，所述经扩增的til为经过体外扩增的til。

4、在一种实施方式中，所述经扩增的til为使源自肿瘤组织且未经体外扩增的til经过至少一个阶段的体外扩增后获得的til。

5、在一种实施方式中，与所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的til相比，所述经扩增的til的数量增加至少1倍。

6、在一种实施方式中，其中所述经扩增的til经所述共培养后数量增加至至少50倍。

7、在一种实施方式中，其中所述经扩增的til经所述共培养后数量增加至约50-20000倍。

8、另一方面，本技术提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(til)的方法，其包括：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的til经过至少一个阶段的体外扩增，其中在单个体外扩增阶段中，使经体外扩增和/或未经体外扩增的til在与t细胞共刺激分子和/或t细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。

9、在一种实施方式中，在第一个阶段的体外扩增中，使所述未经体外扩增的til在与t细胞共刺激分子和/或t细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。

10、在一种实施方式中，使源自肿瘤组织且未经体外扩增的til经过至少两个阶段的体外扩增，且在第二个阶段的体外扩增中，使经体外扩增til在与t细胞共刺激分子和/或t细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。

11、在一种实施方式中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的til经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述til与所述饲养细胞共培养。

12、在一种实施方式中，所述第一阶段体外扩增进行至少约7天。

13、在一种实施方式中，所述第一阶段体外扩增进行约7天至约14天。

14、在一种实施方式中，所述第二阶段体外扩增进行至少约7天。

15、在一种实施方式中，所述第二阶段体外扩增进行约7天至约14天。

16、在一种实施方式中，与在单个体外扩增阶段中使经体外扩增和/或未经体外扩增的til在与t细胞共刺激分子和/或t细胞生长因子接触同时与饲养细胞共培养相比，在单个体外扩增阶段中使经体外扩增和/或未经体外扩增的til在与t细胞共刺激分子和/或t细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养提高til的扩增效果和/或显示出改善的til特性。

17、在一种实施方式中，所述改善的til特性包含选自以下组的一种或多种：增加的til细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的t细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的t细胞受体(tcr)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中til细胞数量。

18、在一种实施方式中，所述提高til的扩增效果包括选自以下组的一种或多种：增加til细胞的数量，改变til细胞的比例，提高til细胞的分泌能力，和提高til细胞的杀伤能力。

19、在一种实施方式中，所述改变til细胞的比例包括选自以下组的一种或多种：增加til中中心记忆t细胞比例，降低调节性t细胞的比例，增加活化t细胞比例，增加肿瘤特异性t细胞比例，和增加干细胞样t细胞比例。

20、在一种实施方式中，所述一定时间为至少约2小时。

21、在一种实施方式中，所述一定时间为约6到72小时。

22、在一种实施方式中，所述一定时间为约12到48小时。

23、在一种实施方式中，所述一定时间为约6、12、24、48或72小时。

24、在一种实施方式中，使所述til在与所述t细胞激活剂和/或所述t细胞生长因子接触约12小时或更多时间之后与所述饲养细胞共培养。

25、在一种实施方式中，使所述til在与所述t细胞激活剂和/或所述t细胞生长因子接触约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。

26、在一种实施方式中，所述t细胞共刺激分子选自以下组的一种或多种：cd80、cd86、b7-h3、4-1bbl、cd27、cd30、cd134、b7h、cd40、light、特异性结合cd3的抗体、特异性结合cd28的抗体、特异性结合hvem的抗体、特异性结合cd40l的抗体、特异性结合ox40的抗体和特异性结合4-1bb的抗体。例如，t细胞共刺激分子选自以下组的一种或多种：分化簇80(cd80)、cd86、cd276、4-1bb配体(4-1bbl)、cd27、cd30、cd134、cd275、cd40、cd258、以及它们的功能活性片段。例如，t细胞共刺激分子选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：cd3、cd28、疱疹病毒进入介质(hvem)、cd40l、ox40和4-1bb。

27、在一种实施方式中，所述t细胞激活剂包含cd3激动剂和/或cd28激动剂。

28、在一种实施方式中，所述t细胞激活剂包含cd3激动剂。

29、在一种实施方式中，所述t细胞激活剂包含抗cd3的抗体和/或其抗原结合片段。

30、在一种实施方式中，所述t细胞激活剂包含cd28激动剂。

31、在一种实施方式中，所述t细胞激活剂包含抗cd28的抗体和/或其抗原结合片段、cd80和/或其功能活性片段和/或cd86和/或其功能活性片段。

32、在一种实施方式中，所述t细胞共刺激分子为特异性结合cd3的抗体。

33、在一种实施方式中，使一种所述t细胞共刺激分子、或多种t细胞共刺激分子的每一种与所述til单独接触。

34、在一种实施方式中，使多种所述t细胞共刺激分子与所述til同时接触。

35、在一种实施方式中，分别单独加入一种所述t细胞共刺激分子、或多种t细胞共刺激分子的每一种到所述til的细胞培养基中。

36、在一种实施方式中，同时加入多种所述t细胞共刺激分子到所述til的细胞培养基中。

37、在一种实施方式中，一种所述t细胞共刺激分子以以下组的形式的一种或多种加入到所述til的细胞培养基中：表达所述t细胞共刺激分子的工程化细胞，包含所述t细胞共刺激分子的纳米颗粒，和包含所述t细胞共刺激分子的聚合物。

38、在一种实施方式中，多种所述t细胞共刺激分子以选自以下组的形式加入到所述til的细胞培养基中：混合物，融合蛋白，表达多种所述t细胞共刺激分子的工程化细胞，包含多种所述t细胞共刺激分子的纳米颗粒，和包含多种所述t细胞共刺激分子的聚合物。

39、在一种实施方式中，所述t细胞生长因子选自以下组的一种或多种：il-2、il-4、il-7、il-10、il-12、il-15、il-21、和γ干扰素。

40、在一种实施方式中，所述t细胞生长因子选自以下组的一种或多种：il-2、il-7、il-12、il-15、il-21、和γ干扰素。

41、在一种实施方式中，所述t细胞生长因子为il-2和/或其功能活性片段。

42、在一种实施方式中，每一种所述t细胞生长因子在所述til的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300iu/ml。

43、在一种实施方式中，所述il-2在所述til的细胞培养基中的初始浓度为至少1000iu/ml。

44、在一种实施方式中，使一种所述t细胞生长因子、或多种t细胞生长因子的每一种与所述til单独接触。

45、在一种实施方式中，使多种所述t细胞生长因子与所述til同时接触。

46、在一种实施方式中，分别单独加入一种所述t细胞生长因子、或多种t细胞生长因子的每一种到所述til的细胞培养基中。

47、在一种实施方式中，同时加入多种所述t细胞生长因子到所述til的细胞培养基中。

48、在一种实施方式中，一种所述t细胞生长因子以选自以下组的形式的一种或多种加入到所述til的细胞培养基中：表达所述t细胞生长因子的工程化细胞，包含所述t细胞生长因子的纳米颗粒，和包含所述t细胞生长因子的聚合物。

49、在一种实施方式中，多种所述t细胞生长因子以选自以下组的形式的一种或多种加入到所述til的细胞培养基中：混合物，融合蛋白，表达多种所述t细胞生长因子的工程化细胞，包含多种所述t细胞生长因子的纳米颗粒，和包含多种所述t细胞生长因子的聚合物。

50、在一种实施方式中，所述til为源自肿瘤组织的碎片的til和/或源自冷冻保存后复苏的til。在一种实施方式中，所述til为源自所述肿瘤组织的碎片的til。

51、在一种实施方式中，所述碎片的体积约为1-27立方毫米。

52、在一种实施方式中，所述碎片的体积约为27立方毫米。

53、在一种实施方式中，所述饲养细胞包括抗原呈递细胞。

54、在一种实施方式中，所述饲养细胞包括选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞，和人工抗原呈递细胞。

55、在一种实施方式中，所述饲养细胞为外周单个核细胞。

56、在一种实施方式中，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。

57、在一种实施方式中，所述til和饲养细胞共培养包括将所述饲养细胞的表面与所述til的表面相接触。

58、在一种实施方式中，所述til和饲养细胞共培养包括将所述饲养细胞加入所述til的细胞培养基中。

59、在一种实施方式中，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述til的比例，将所述饲养细胞添加至所述til的细胞培养基中。

60、在另一方面，本技术提供一种肿瘤浸润淋巴细胞(til)，所述til经过本技术所述的方法获得。

61、在另一方面，本技术提供一种组合物，其包含本技术所述的til。

62、在另一方面，本技术提供一种药物组合物，其包含本技术所述的til和/或本技术所述的组合物，以及任选地药学上可接受的载体。

63、在另一方面，本技术提供一种影响肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者施用本技术所述的til和/或本技术所述的药物组合物。例如，所述影响肿瘤细胞生长的方法可以是体外方法。例如，所述影响肿瘤细胞生长的方法可以是离体方法。例如，所述影响肿瘤细胞生长的方法可以是非诊断且非治疗目的方法。例如，所述影响肿瘤细胞生长的方法可以是非治疗目的方法。例如，所述影响肿瘤细胞生长的方法可以是非诊断目的方法。

64、在另一方面，本技术提供一种本技术所述的til和/或本技术所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。

65、在一种实施方式中，所述肿瘤选自实体瘤。

66、在一种实施方式中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。

67、在另一方面，本技术提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包括向受试者施用本技术所述的til和/或本技术所述的药物组合物。

68、在一种实施方式中，所述肿瘤选自实体瘤。

69、在一种实施方式中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。

70、在另一方面，本技术提供一种本技术所述的til和/或本技术所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗肿瘤。

71、在另一方面，本技术提供一种本技术所述的til和/或本技术所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗肿瘤，其中，所述肿瘤选自实体瘤。

72、在另一方面，本技术提供一种本技术所述的til和/或本技术所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗肿瘤，其中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。

73、本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。