一种黄梁木SSR分子标记引物组合及其应用

本发明属于分子标记。更具体地，涉及一种黄梁木ssr分子标记引物组合及其应用。

背景技术：

1、黄梁木(neolamarckia cadamba)又名团花，是茜草科(rubiaceae)团花属(neolamarckia)的落叶大乔木。因其生长快、出材量大、纹理通直、不易变形开裂，可作为家具、建筑装饰用材等的原材料。此外，黄梁木枝叶舒展，挺拔秀丽，也是良好的园林绿化树种。黄梁木在造林、药用、用材、饲料、绿化等方面都具有非常高的经济价值与应用前景。

2、然而，黄梁木人工林培育中所存在的问题也逐渐暴露出来，包括黄梁木的优质种质资源匮乏、优良亲本筛选效率低、培育目标不明确、人工林种源来源单一及种质混杂等。为了解决上述问题，更好的发展和利用黄梁木产业，需对世界范围的黄梁木野生种质资源进行收集，深入了解黄梁木的生长和遗传特性，对黄梁木野生种质资源进行遗传解析，探究黄梁木的遗传背景和发育机理，为黄梁木的种源鉴定、优质种源筛选和引种培育等方面提供重要依据。

3、基于脱氧核糖核酸(dna)多态性的分子标记正逐渐成为分析生物遗传多样性的有利工具。yiing等人(2014)虽利用简单重复间序列标记(issr)以及核基因片段对马来西亚沙捞越州(sarawak)黄梁木的野生与栽培群体进行了遗传多样性研究，但issr揭示遗传差异性的效果不佳，在检测亲缘关系较近的种群遗传多样性时效率也不高，且试验重复性也稍差。因此，需要具有较高多态性的分子标记。简单重复序列(simple sequence repeat，ssr)是一种基于聚合酶链式反应(pcr)的第二代分子标记技术，由1～6个核苷酸基元串联组成，长度一般在200bp左右。通过对目标植物物种进行ssr分子标记开发，可以更好的为物种遗传多样性分析、种源鉴定及构建遗传连锁图谱等方面提供依据，有利于优质种源筛选和引种培育等方面。

4、目前，ssr分子标记已广泛应用于各种植物类型，但针对黄梁木的ssr分子标记开发还未见报道。由于不同植物的遗传背景不同，对于如何获得可用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析等的ssr分子标记，仍有待解决。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种黄梁木ssr分子标记引物组合及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种黄梁木ssr分子标记引物组合。

3、本发明的第二个目的是提供所述ssr分子标记引物组合在黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供ssr分子标记引物组合在制备用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建的产品中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供一种黄梁木ssr分子标记检测试剂盒。

6、本发明的第五个目的是提供所述ssr分子标记检测试剂盒在黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供ssr分子标记检测试剂盒在制备用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建的产品中的应用。

8、本发明的第七个目的是提供一种鉴定黄梁木种源的方法。

9、本发明的第八个目的是提供一种分析黄梁木遗传多样性的方法。

10、本发明的第九个目的是提供一种黄梁木遗传连锁图谱的构建方法。

11、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

12、本发明提供了一种黄梁木ssr分子标记引物组合，包括引物对th02、th03、th06、th11、th12、th15、th16、th19、th22、th23、th27、th32、th33、th36、th37、th42、th43、th45、th54、th72、th78、th81、th82、th83和th84；所述th02的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.1～2所示；所述th03的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq idno.3～4所示；所述th06的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.5～6所示；所述th11的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.7～8所示；所述th12的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.9～10所示；所述th15的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.11～12所示；所述th16的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.13～14所示；所述th19的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.15～16所示；所述th22的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq idno.17～18所示；所述th23的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.19～20所示；所述th27的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.21～22所示；所述th32的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.23～24所示；所述th33的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.25～26所示；所述th36的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.27～28所示；所述th37的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.29～30所示；所述th42的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.31～32所示；所述th43的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq idno.33～34所示；所述th45的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.35～36所示；所述th54的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.37～38所示；所述th72的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.39～40所示；所述th78的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.41～42所示；所述th81的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.43～44所示；所述th82的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.45～46所示；所述th83的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq id no.47～48所示；所述th84的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如seq idno.49～50所示。

13、利用本发明上述ssr分子标记引物组合，可进行黄梁木(neolamarckia cadamba)种源鉴定、遗传多样性分析和遗传连锁图谱构建。因此，本发明请求保护所述的ssr分子标记引物组合在黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建中的应用。

14、本发明还请求保护所述的ssr分子标记引物组合在制备用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建的产品中的应用。

15、本发明还提供了一种黄梁木ssr分子标记检测试剂盒，所述试剂盒中含有本发明所述的ssr分子标记引物组合。

16、具体地，所述试剂盒中还含有pcr反应所需试剂。

17、本发明还请求保护所述的ssr分子标记检测试剂盒在黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建中的应用。

18、本发明还请求保护所述的ssr分子标记检测试剂盒在制备用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建的产品中的应用。

19、本发明还提供了一种鉴定黄梁木种源的方法，包括以下步骤：

20、s1.提取黄梁木植株的总dna；

21、s2.以步骤s1所得总dna为模板，以所述的ssr分子标记引物组合进行pcr扩增；

22、s3.毛细管电泳检测步骤s2的扩增产物，收集数据；

23、s4.对步骤s3的数据进行处理，对黄梁木群体进行聚类分析。

24、本发明还提供了一种分析黄梁木遗传多样性的方法，包括以下步骤：

25、s1.提取黄梁木植株的总dna；

26、s2.以步骤s1所得总dna为模板，以所述的ssr分子标记引物组合进行pcr扩增；

27、s3.毛细管电泳检测步骤s2的扩增产物，收集数据；

28、s4.对步骤s3的数据进行处理，计算黄梁木的遗传多样性参数；

29、s5.对步骤s4所得参数进行黄梁木遗传多样性分析。

30、本发明还提供了一种黄梁木遗传连锁图谱的构建方法，包括以下步骤：

31、s1.提取黄梁木植株的总dna；

32、s2.以步骤s1所得总dna为模板，以所述的ssr分子标记引物组合进行pcr扩增；

33、s3.毛细管电泳检测步骤s2的扩增产物，收集数据；

34、s4.对步骤s3的数据进行处理，构建出黄梁木的ssr指纹图谱。

35、具体地，pcr扩增所用反应体系为：dna 1.5μl，easy taq 0.4μl，正向引物和反向引物各0.8μl，dntp 1.5μl，ddh2o补足20μl；所用反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，53或58℃退火35s，72℃延伸35s，共35个循环；72℃完全变性7min。

36、具体地，所述正向和反向引物的浓度为10μmol。

37、本发明具有以下有益效果：

38、本发明提供了一种黄梁木ssr分子标记引物组合，利用所述引物组合不仅可以实现对黄梁木的种源鉴定，亦可将其用于黄梁木遗传多样性分析及遗传连锁图谱的构建等，具有多态性高、重复性好、标记稳定、带型清晰易判读等优点。通过种源鉴定即可筛选出优异的种质资源，有利于黄梁木的优质种源筛选、引种和人工培育。此外，本发明还提供了一种黄梁木ssr分子标记检测试剂盒，可将其用于黄梁木的种源鉴定、dna指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究等方面。本发明为黄梁木的分子辅助育种提供了新的工具，有助于黄梁木的分子辅助育种，具有良好的应用前景。