硫氧还蛋白1表位及与其特异性结合的单克隆抗体的制作方法

本发明涉及硫氧还蛋白1(trx1)抗原的表位及与其特异性结合的单克隆抗体，更详细地，涉及上述表位及与其结合的单克隆抗体或其抗原结合片段、用于编码上述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子、包含上述核酸分子的重组载体、宿主细胞、上述抗体或其抗原结合片段的制备方法、乳腺癌诊断用试剂盒、为乳腺癌诊断提供所需信息的方法。

背景技术：

1、硫氧还蛋白(thioredoxin，trx)为借助硫氧还蛋白还原酶进行nadph依赖还原的12kda左右的小的氧化还原蛋白质，包括哺乳类硫氧还蛋白1(trx1)及硫氧还蛋白2(trx2)。硫氧还蛋白作为生长因子起作用，去除在细胞内产生毒素的过氧化氢，在细菌中用作核糖核苷酸还原酶且起到使与转录活动相关的重要的要素与dna结合的作用，在真核细胞中，对作为与转录相关的因子的nf-kb(nuclear transcription factor kb)的活性产生影响。因此，硫氧还蛋白由于对细胞凋亡和肿瘤产生影响而具有调节癌细胞生长的重要的作用，通过切断氧化的其他蛋白质的二硫键来帮助其重新具有还原状态的活性。硫氧还蛋白1酶和硫氧还蛋白2酶在哺乳动物细胞内去除半胱氨酸的氧化氮而对细胞凋亡产生影响，在包括炎症疾病、心脏麻痹、癌症在内的多种疾病中具有潜在性的重要性。并且，在利用抗-硫氧还蛋白抗体的免疫组织化学分析中，在包括肝脏、结肠、胰脏以及子宫颈的人类癌组织产生硫氧还蛋白的表达，这种表达意味着可能在肿瘤诱发过程中的硫氧还蛋白牵涉可能性。

2、在这种背景下，本发明人在研究能够在早期预测乳腺癌的诊断或预后的乳腺癌诊断用标记物的过程中，发现了硫氧还蛋白1在正常乳腺组织中产生低表达，但在乳腺癌组织中产生非常高的表达，且证实了硫氧还蛋白1作为乳腺癌诊断用标记物而非常有用(韩国授权专利第10-1058230号)。

3、为了开发具有高准确性和精密度的基于酶联免疫吸附分析法(elisa，enzyme-link ed immunosorbent assay)的体外诊断(in vitro diagnostics，ivd)，需要相同抗原蛋白质的各个其他部位具有高亲和性(affinity)的抗体对(两种)。同时，也需要具备每次以低成本生产具有规定的亲和性的抗体的系统。对此，本发明中，为了检测存在于人类血清中的硫氧还蛋白1(thioredoxin-1，trx1)，开发了两种高性能的重组单克隆抗体，上述抗体有效地与硫氧还蛋白1特异性结合，从而确认了上述抗体有用于筛选乳腺癌患者，并且，确认了上述两种抗体与人类trx1抗原抗原相结合的位点，由此完成了本发明。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明为了解决如上所述的问题而提出，并且提供可通过高灵敏度和特异性来诊断乳腺癌的单克隆抗体或其抗原结合片段。

3、本发明的再一目的在于，提供用于编码上述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子。

4、本发明的另一目的在于，提供包含上述核酸分子的重组载体。

5、本发明的还一目的在于，提供包含上述重组载体的宿主细胞。

6、本发明的又一目的在于，提供与上述单克隆抗体或其结合片段结合的人硫氧还蛋白1抗原的表位、编码其的核酸分子、包含上述核酸分子的重组载体以及包含上述重组载体的宿主细胞。

7、本发明的又一目的在于，提供包括培养上述宿主细胞的步骤的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法。

8、本发明的又一目的在于，提供包含上述的单克隆抗体或其抗原结合片段的乳腺癌诊断试剂盒。

9、本发明的又一目的在于，提供利用上述的单克隆抗体或其抗原结合片段来为乳腺癌诊断提供所需信息的方法。

10、解决问题的手段

11、为了解决如上所述的问题，本发明提供与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：轻链可变区，包含由序列1的氨基酸序列形成的轻链cdr1、由序列2的氨基酸序列形成的轻链cdr2及由序列3的氨基酸序列形成的轻链cdr3；以及重链可变区，由序列4的氨基酸序列形成的重链cdr1、由序列5的氨基酸序列形成的重链cdr2及由序列6的氨基酸序列形成的重链cdr3。

12、根据本发明一优选实施例，上述抗体可包含由序列13的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列14的氨基酸序列形成的重链可变区。

13、根据本发明再一优选实施例，上述抗体可包含由序列17的氨基酸序列形成的轻链及由序列18的氨基酸序列形成的重链。

14、本发明还提供与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：轻链可变区，包含由序列7的氨基酸序列形成的轻链cdr1、由序列8的氨基酸序列形成的轻链cdr2及由序列9的氨基酸序列形成的轻链cdr3；以及重链可变区，包含由序列10的氨基酸序列形成的重链cdr1、由序列11的氨基酸序列形成的重链cdr2及由序列12的氨基酸序列形成的重链cdr3。

15、根据本发明一优选实施例，上述抗体可包含由由序列15的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列16的氨基酸序列形成的重链可变区。

16、根据本发明再一优选实施例，上述抗体可包含由序列19的氨基酸序列形成的轻链以及由序列20的氨基酸序列形成的重链。

17、根据本发明另一优选实施例，上述抗体可包含由序列25的氨基酸序列形成的轻链以及由序列26的氨基酸序列形成的重链。

18、根据本发明还一优选实施例，上述抗体可包含igg1重链及κ轻链。

19、根据本发明又一优选实施例，上述抗原结合片段可以为fab、f(ab')、f(ab')2、f v或单链抗体分子。

20、根据本发明又一优选实施例，上述抗体可以为嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。

21、本发明还提供用于编码上述的抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子。

22、根据本发明一优选实施例，用于编码上述轻链的核酸分子可由序列21的核苷酸序列、序列23的核苷酸序列或序列37的核苷酸序列形成。

23、根据本发明一优选实施例，用于编码上述重链的核酸分子可由序列22的核苷酸序列、序列24的核苷酸序列或序列28的核苷酸序列形成。

24、本发明还提供包含用于编码上述重链的核酸分子、用于编码上述轻链的核酸分子或用于编码上述重链及轻链的核酸分子的重组载体、以及包含其的宿主细胞。

25、本发明还提供由选自由序列32至34及序列172至176组成的组中的一种氨基酸序列形成的人硫氧还蛋白1抗原的表位及编码其的核酸分子。

26、根据本发明一优选实施例，上述核酸分子可由选自由序列35至37及177至181组成的组中的一种核苷酸序列形成。

27、本发明还提供包含上述核酸分子的重组载体以及包含其的宿主细胞。

28、本发明还提供与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法，该方法包括培养包括包含用于编码上述抗体的重链的核酸分子、用于编码轻链的核酸分子或用于编码重链及轻链的核酸分子的重组载体的宿主细胞的步骤。

29、本发明还提供包含上述抗体或其抗原结合片段的乳腺癌诊断试剂盒。

30、根据本发明一优选实施例，上述试剂盒可以为酶联免疫吸附分析(enzyme linkedimmunosorbent assay)试剂盒。

31、根据本发明另一优选实施例，上述酶联免疫吸附分析可以为选自由直接酶联免疫吸附分析、间接酶联免疫吸附分析、直接夹心酶联免疫吸附分析及间接夹心酶联免疫吸附分析组成的组中的一种以上。

32、本发明提供为乳腺癌诊断提供所需信息的方法，该方法包括：步骤(a)，使上述单克隆抗体或其抗原结合片段与从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样接触；步骤(b)，通过形成抗原-抗体复合物来对在上述生物学试样中与单克隆抗体或其抗原结合片段结合的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平进行检测；以及步骤(c)，将在上述步骤(b)中所检测的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平与对照组进行比较，若上述蛋白质表达水平比对照组高，则判定为乳腺癌患者。

33、进一步地，本发明提供为乳腺癌诊断提供所需信息的方法，该方法包括：步骤(a)，利用包含抗体b266或b266-1的轻链cdr1至cdr3及重链cdr1至cdr3的单克隆抗体或其抗原结合片段、包含抗体b266或b266-1的轻链可变区及重链可变区的单克隆抗体或其抗原结合片段或者抗体b266或b266-1或其抗原结合片段涂敷固体支撑体；步骤(b)，将从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样适用于所涂敷的上述固体支撑体；步骤(c)，去除未结合的样品；步骤(d)，利用包含抗体b264的轻链cdr1至cdr3及重链cdr1至cdr3的单克隆抗体或其抗原结合片段、包含抗体b264的轻链可变区及重链可变区的单克隆抗体或其抗原结合片段或抗体b264或其抗原结合片段适用于固体支撑体；步骤(e)，去除未结合的单克隆抗体或其抗原结合片段；步骤(f)，检测硫氧还蛋白1蛋白质的表达水平；以及步骤(g)，将在上述步骤(f)所检测的硫氧还蛋白1蛋白质的表达水平与对照组进行比较，若上述蛋白质表达水平比对照组高，则判定为乳腺癌患者。

34、根据本发明一优选实施例，上述硫氧还蛋白1蛋白质的表达水平可通过选自由蛋白质印迹法、酶联免疫吸附分析法、夹心酶联免疫吸附分析法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、琼脂双向免疫扩散法、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、免疫色谱分析法、荧光激活细胞分选法(facs)以及蛋白质芯片方法中的一种以上方法组成的组中的一种方法来检测.

35、根据本发明另一优选实施例，所分离的上述生物学试样可以为选自由全血、血清、血浆、乳腺组织以及乳腺细胞组成的组中的一种以上。

36、除另有定义，本说明书中所使用的所有技术术语及科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义具有相同的含义。一般而言，本发明中所使用的命名方式为在本技术领域中公知且通常所使用的。

37、本文中所使用的主要术语的定义如下所述。

38、术语“抗原”可通过抗体而结合，是指为了生产可与抗原的表位结合的抗体而可使用于动物的分子或分子的一部分。抗原可具有一个以上的表位。

39、术语“抗体”或“ab”为位于免疫球蛋白分子的可变区的通过一个以上的抗原识别部位来识别如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等特异性靶或抗原并可与其结合的免疫球蛋白分子。如本文所述，术语“抗体”包括但不限定于单克隆抗体；多克隆抗体；如fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、fc等具有可与特定抗原(例如，trx1)特异性结合的能力的抗体的“抗原结合片段；”单独的互补性决定区(cdr)；双特异性抗体；异质接合体抗体、其突变体；具有抗体、或其抗原-结合性片段(例如，结构域抗体)的融合蛋白质；单链(scfv)及单域抗体[例如，鲨鱼及骆驼科动物(camelid)抗体]；最大抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、细胞内抗体(intrabody)、双链抗体(diabody)、三链抗体(tria body)、四链抗体(tetrabody)、v-nar以及bis-scfv；人源化抗体；嵌合抗体；以及包含所需的特异性的抗原识别部位的免疫球蛋白分子的其他所有变形的空间构象(包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体以及共价性变形的抗体)的任何类型的抗体。抗体可为来源于鼠科动物、大鼠、人类或其他的所有抗体(包括嵌合抗体或人源化抗体)。

40、在相关技术领域中，与特定靶或抗原(例如，trx1蛋白)“特异性结合”的抗体或多肽为广泛理解的术语，决定这种特异性结合的方法在相关技术领域中也是广为人知的。相比于特定分子与其他细胞或物质反应或结合的情况，在特定分子以更经常、更迅速、更大的持续性和/或更大的亲和性与特殊的细胞或物质反应或结合的情况下，呈现“特异性结合”。相比于特定抗体与其他物质反应或结合的情况，在特定抗体以更大的亲和性、结合活性、更迅速和/或更大的持续性结合的情况下，与特定靶或抗原“特异性结合”。

41、本文中所使用的“结合亲和性”或“kd”是指特殊的抗原-抗体相互作用的平衡解离常数。kd为解离速度(也称为“脱离速度”或“kd”)与结合速度、或“启动速度”或“ka(结合速率常数，association rate constant)”之比。因此，kd为kd/ka，以摩尔浓度(m)来表示。kd越小，结合亲和性越强。因此，1μm的kd比1nm的kd呈现出弱的结合亲和性。与抗体有关的kd值可在相关技术领域中利用公知的方法来决定。用于决定抗体的kd的一种方法为使用如系统等典型的生物传感器系统来利用表面等离子共振仪的方法。

42、术语“载体”包含可运输连接的其他核酸的核酸分子。载体的一种形态为“质粒，”其是指可结合有附加的dna片段的圆形双链dna环。载体的其他形态为病毒载体，其中，附加的dna片段可与病毒基因组结合。有些载体可在它们被转导的宿主细胞中自主地进行复制(例如，具有细菌起源复制的细菌载体及游离基因哺乳动物载体)。当其他载体(例如，非游离基因哺乳动物载体)转导至宿主细胞时，可合并为宿主细胞的基因组，由此，复制宿主基因组。并且，某些载体可指示它们启动性连接的(operatively linked)基因的表达。上述载体在本说明书中称为“重组表达载体(或简单地称为“表达载体”)”。通常，在重组dna技术中有用的表达载体往往以质粒的形态存在。在本说明书中，“质粒”及“载体”为质粒用作最通常所使用的载体的形态，因此可相互交换来使用。但是，本发明包括具有同等功能的其他形态的表达载体，例如，病毒载体(例如，复制缺乏逆转录病毒、腺病毒以及腺相关病毒)。

43、术语“宿主细胞”是指能够表达转化或者可表达由核酸序列转化后选定的感兴趣的基因的细胞。只要存在选定的基因，不管子孙与父母在形态上或遗传结构上是否相同，上述术语包括母细胞的子孙。

44、发明的效果

45、本发明的单克隆抗体由于对硫氧还蛋白1的结合亲和性优秀而有效地与硫氧还蛋白1特异性结合，并且，由于灵敏度和特异度非常高而可有用地使用于乳腺癌患者的筛选中。进而，相比于检测作为以往的其他乳腺癌诊断生物标记物的ca15-3，使用本发明的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体来检测硫氧还蛋白1能够由于其优秀的灵敏度和特异度而使乳腺癌诊断的准确性及可靠性明显得到提高。本发明的抗体所结合的人类trx1抗原的表位位点可有效地适用于用作改善抗-trx1抗体的结合亲和性的改良抗体的开发。