菘蓝中的螺吲哚酮类生物碱化合物及其制备方法和应用

：本发明属于医药，尤其涉及植物菘蓝中的新螺吲哚酮类生物碱化合物及其制备方法和这类化合物在抗神经炎症方面的应用。

背景技术

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背景技术：

1、菘蓝：菘蓝[isatis indigotica fortune]，属于十字花科菘蓝属植物，二年生草本，原产于我国，在全国各地均有栽培。菘蓝叶在我国用药历史悠久，最初记载于《民医别录》，其干燥根作板蓝根入药，干燥叶作大青叶入药。性寒，味苦。

2、随着全球人口老龄化的进程，神经退行性疾病受到越来越多的关注，其中阿尔茨海默氏症和帕金森症等正成为导致中老年人死亡的主要杀手。近年来的研究表明，小胶质细胞(bv2)主导的神经炎症在神经退行性疾病的发展过程中发挥重要的作用。抑制神经炎症反应可以延缓神经退行性疾病的进程，同时能够防止神经元发生病变，对于治疗神经退行性疾病有着很好的前景。

3、本发明人对菘蓝开展深入研究，发现其中含有多种结构新颖的螺吲哚酮类生物碱化合物，并表现出很好的抗神经炎症活性。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供了菘蓝中具有新颖结构的螺吲哚酮类生物碱化合物及其制备方法和在制备抗神经炎症方面的药物中的应用。

2、为了达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案。

3、在第一个方面中，本发明提供了4种从十字花科菘蓝属植物菘蓝[isatisindigotica fortune]中分离得到的新螺吲哚酮类生物碱化合物，所述化合物的结构如下所示：

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5、在第二个方面中，本发明所述螺吲哚酮类生物碱化合物的制备方法包括如下步骤：

6、取干燥的菘蓝全草以80％工业乙醇回流提取两次，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用二氯甲烷萃取并将所得组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1-0:100进行梯度洗脱，共收集到4个组分(a-d)。

7、组分c经聚酰胺柱色谱，以乙醇-水系统0:100-100:0进行梯度洗脱，得两个组分c1和c2。利用hp20柱色谱将组分c2以乙醇-水系统30:70-90:10进行梯度洗脱，得四个组分(a-d)。

8、所得组分b经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统100:1-10:1在tlc分析的基础上得到四个亚组分(b1-b4)。

9、在制备性反相高效液相色谱上使用甲醇-水(70:30，v/v)的流动相来分离b1和b2得到了化合物1-4。其中化合物3和化合物4是使用手性色谱柱进行拆分得到的一对对映异构体。

10、所述提取为回流提取，提取2次，每次4小时。

11、在所述制备方法中，使用的菘蓝为十字花科菘蓝属植物菘蓝[isatis indigoticafortune]。

12、所得化合物经过系统结构鉴定结果如下(如表1-3和图1-25所示)：

13、利用高分辨质谱，一维nmr、二维nmr及计算ecd对化合物1-4的结构鉴定。

14、iatinoline e(1)黄色油状物(甲醇)。(c 0.1,meoh)。hresims给出准分子离子峰384.1062[m+na]+(calcd.for c18h19no7na,384.1054)，结合1h和13c-nmr数据确定其分子式为c18h19no7，不饱和度为10。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)谱中，δh 7.69(1h,d,j＝7.6hz,h-4),6.97(1h,t,j＝7.6hz,h-5),7.07(1h,t,j＝7.6hz,h-6),7.27(1h,d,j＝7.6hz,h-7)提示为1,2-二取代的苯环氢信号。δh 10.95(1h,s,h-1)为一个活泼的氮氢信号，δh 6.06(1h,s,h-7')提示为烯氢信号，δh 4.51(1h,d,j＝7.1hz,h-1'),4.58(1h,overlapped,h-2'),5.01(1h,d,j＝8.2hz,h-4'),3.20(1h,m,h-5')为四个连氧次甲基信号，δh 3.71(1h,m,h-6'a),3.62(1h,m,h-6'b),4.59(2h,overlapped,h-1")为连氧亚甲基氢信号，δh 6.76(1h,d,j＝5.9hz,2'-oh),5.06(1h,t,j＝5.5hz,6'-oh)为两个羟基氢信号，δh 3.28(3h,s,1"-och3)为两个甲氧基氢信号。13c-nmr(100mhz,dmso-d6)谱中给出18个碳信号，其中δc 111.4,117.8,118.6,120.3,121.7,133.0为苯环碳信号，δc 124.6(c-2),134.0(c-3),172.1(c-3'),112.4(c-7')为双键碳信号，δc172.1(c-8')为羰基碳信号，δc108.2(c-1'),70.5(c-2'),76.5(c-4'),78.3(c-5')为连氧次甲基碳信号，δc 61.0(c-6'),63.3(c-1")为连氧亚甲基碳信号，δc 57.2(1"-och3)为甲氧基碳信号。

15、在hmbc谱中，h-1与c-2,c-3,c-3a存在相关，h-4与c-6,c-7a存在相关，h-5与c-3a存在相关，h-7与c-3a,c-5存在相关，提示该化合物的母核为吲哚环。h-2'和c-1',c-3',c-7'相关，h-4'和c-5',c-6',c-8'相关，h-7'与c-4',c-8'相关，证明存在六元氧杂环骈五元氧杂环的结构。h-1'与c-3的相关信号证明了六元氧杂环c-1'位与吲哚环的c-3位通过一个氧原子相连。h-1"与c-2,c-3存在相关，甲氧基氢(δh 3.28)与c-1"存在相关，确定了-ch2och3片段的连接位置。因此，确定化合物1的平面结构。

16、化合物1的相对构型是通过noesy谱和偶合常数来确定的。h-4'和h-5'之间的偶合常数jh-4',h-5'＝8.2hz，提示h-4'和h-5'处于相反平面。在noesy谱中，h-1'与h-5'，h-4'与h-2',h-6'的相关信号，提示h-1'和h-5'在六元含氧环的同侧，而h-2'和h-4'在环的另一侧。因此，确定该化合物的相对构型。

17、化合物1的绝对构型是通过比较计算和实测ecd来确定的。实验ecd谱中的cotton效应峰与预设为1's,2'r,4's,5'r构型的计算ecd谱中的cotton效应峰较为吻合，因此确定化合物1的绝对构型为1's,2'r,4's,5'r构型。

18、表1化合物1(dmso-d6)的1h(400mhz)和13c(100mhz)数据

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21、iatinoline f(2)棕色固体(甲醇)。(c 0.1,meoh)。hresims给出准分子离子峰461.0970[m+na]+(calcd.for c22h18n2o8na,461.0955)，结合1h和13c-nmr数据确定其分子式为c22h18n2o8，不饱和度为15。1h-nmr(600mhz,dmso-d6)谱中，δh 7.61(1h,d,j＝8.0hz,h-4),7.29(1h,t,j＝8.0hz,h-5),7.80(1h,t,j＝8.0hz,h-6),8.37(1h,d,j＝8.0hz,h-7)提示为1,2-二取代的苯环氢信号。δh 7.51(1h,d,j＝7.6hz,h-4'),6.83(1h,overlapped,h-5'),7.39(1h,t,j＝7.6hz,h-6'),6.83(1h,overlapped,h-7')提示为另一组1,2-二取代的苯环氢信号。δh 7.74(1h,s,h-1),7.02(1h,s,h-1')为活泼的氮氢信号。δh4.99(1h,s,h-10),4.23(1h,d,j＝4.4hz,h-11),3.82(1h,t,j＝6.6hz,h-12)为三个次甲基氢信号，δh 3.42(2h,overlapped,h-13)为连氧亚甲基氢信号，δh 6.57(1h,s,9-oh),7.07(1h,d,j＝4.6hz,11-oh),4.83(1h,t,j＝4.8hz,13-oh)为三个羟基氢信号。13c-nmr(100mhz,dmso-d6)谱中给出22个碳信号，其中δc 121.4,124.4,124.9,137.7,116.4,150.7,123.2,123.3,119.0,136.6,112.9,160.4为苯环碳信号，δc 193.3(c-3),196.6(c-3'),167.7(c-8)为羰基碳信号，δc 85.6(c-10),78.9(c-11),89.4(c-12)为次甲基碳信号，δc62.1(c-13)为连氧亚甲基碳信号，δc 90.1(c-2),83.7(c-9),68.1(c-2')为季碳信号。

22、在hmbc谱中，h-7与c-3a,c-5存在相关，h-4与c-7a,c-6,c-3存在相关，h-5与c-3a存在相关，h-1与c-2存在相关，提示存在一个3-吲哚酮结构片段。同理，h-5'与c-3'a,c-7'存在相关，h-4'与c-7'a,c-6',c-3'存在相关，h-1'与c-3',c-3'a存在相关，提示存在另一个3-吲哚酮结构片段。根据以上数据再结合化合物分子式和不饱和度，提示结构中还应存在两个环。h-10与c-11,c-12存在相关，h-12与c-9相关，确定了五元氧杂环的连接方式，同时可推测剩下的一个环应为吡喃酮片段，并与五元氧杂环骈合在c-9和c-10处。h-11与c-13存在相关，确定了羟甲基连接在c-12。羟基氢(δh 6.57)与c-10,c-11存在相关，羟基氢(δh7.07)与c-9存在相关，从而确定了各羟基的连接位置。h-1与c-2,c-2'存在相关，h-1'与c-10存在相关，h-10与c-3'存在相关，提示吡喃酮片段与两个3-吲哚酮结构片段分别在c-2和c-2'处相连。因此，确定化合物2的平面结构。

23、化合物2的相对构型是通过roesy谱确定的。h-12与h-1',11-oh之间存在相关，提示h-12,h-1',11-oh在吡喃酮骈五元氧杂环的同一侧。此外还观察到了h-10与h-1,h-11,9-oh之间的相关信号，提示h-10,h-1,h-11,9-oh在吡喃酮骈五元氧杂环的另一侧。因此，确定该化合物的相对构型。

24、化合物2的绝对构型是通过比较计算和实测ecd来确定的。实验ecd谱中的cotton效应峰与预设为2s,2'r,9r,10s,11s,12s构型的计算ecd谱中的cotton效应峰较为吻合。因此确定化合物2的绝对构型为2s,2'r,9r,10s,11s,12s构型。

25、表2化合物2(dmso-d6)的1h(400mhz)和13c(100mhz)数据

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28、iatinoline g(3)、iatinoline h(4)：白色粉末(甲醇)。(c 0.1,meoh)。hresims给出准分子离子峰477.1654[m+na]+(calcd.for c24h26n2o7na,477.1632)，结合1h和13c-nmr数据确定其分子式为c24h26n2o7，不饱和度为13。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)谱中，δh7.97(1h,d,j＝7.7hz,h-4),7.00(1h,t,j＝7.7hz,h-5),7.18(1h,t,j＝7.7hz,h-6),6.58(1h,d,j＝7.7hz,h-7)提示为1,2-二取代的苯环氢信号。δh 6.00(2h,s,h-2',6')提示为1,3,4,5-四取代的苯环氢信号。δh 10.28(1h,s,h-1)为活泼的氮氢信号。δh 3.47(1h,d,j＝12.2hz,h-1'),3.44(1h,overlapped,h-2'),2.79(1h,m,h-3')为三个次甲基氢信号，δh1.91(1h,m,h-4'a),1.68(1h,m,h-4'b),1.79(2h,m,h-5'),3.10(1h,dd,j＝6.8,8.2hz,h-6'a),2.58(1h,m,h-6'b)为三组亚甲基氢信号，δh 8.17(1h,s,4"-oh)为羟基氢信号。δh3.46(3h,s,7'-och3),3.43(6h,s,3",5"-och3)为甲氧基氢信号。13c-nmr(100mhz,dmso-d6)谱中给出24个碳信号，其中δc 106.7×2,109.5,121.2,124.6,128.1,128.6,129.4,134.5,142.1,147.0×2为苯环碳信号，δc173.1(c-2),171.6(c-7')为羰基碳信号，δc 49.2(c-1'),48.8(c-2'),66.4(c-3')为次甲基碳信号，δc 24.4(c-4'),17.5(c-5'),52.1(c-6')为亚甲基碳信号，δc 83.6(c-3)为季碳信号，δc 51.7(7'-och3),55.7(3",5"-och3)为甲氧基碳信号。

29、在hmbc谱中，h-4与c-3,c-6,c-7a存在相关，h-5与c-7,c-3a存在相关，h-7与c-3a存在相关，h-6与c-7a存在相关，h-1与c-2,c-3,c-3a,c-7a存在相关，提示该化合物母核为2-吲哚酮。羟基氢(δh 8.17)与c-3",c-5"相关，甲氧基氢(δh 3.43)与c-3",c-5"相关，提示存在一个4-羟基-3,5-二甲氧基苯基片段。至此，结合化合物的分子式和不饱和度，除了1h,13c-nmr提供的基团外，结构中还应存在两个环。h-6'与c-3',c-4'存在相关，h-3'与c-1'存在相关，h-2'与c-4'存在相关，特别是在1h-1h cosy谱中观察到了h-1'/h-2'/h-3'/h-4'/h-5'/h-6'之间的相关信号，提示分子中存在一个吡咯环骈六元氧杂环的片段，且根据h-2'与c-3,h-1'与c-3a之间的hmbc相关信号，确定该片段通过c-3与2-吲哚酮母核相连。h-1'与c-2"存在相关，提示4-羟基-3,5-二甲氧基苯基片段连接在c-1'。此外还在hmbc谱中观察到h-1'和甲氧基氢(δh 3.46)都与c-7'存在相关，证明甲氧羰基连接在c-2'。因此，确定化合物3和4的平面结构。

30、化合物3和4的相对构型是通过noesy谱和氢谱偶合常数确定的。h-1'与h-3'之间存在相关，h-4'b与h-2'之间存在相关，h-4与h-2"之间存在相关，且j1',2'＝12.2hz，提示h-1',h-2'处于不同平面。因此，确定该化合物的相对构型。

31、使用手性色谱柱进行拆分，结果得到一对对映异构体3(c 0.1,meoh)}和4(c 0.1,meoh)}，它们的绝对构型是通过比较计算和实测ecd来确定的。3的实验ecd谱中的cotton效应峰与预设为3r,1'r,2's,3'r构型的计算ecd谱中的cotton效应峰较为吻合，因此确定化合物3和4分别为3r,1'r,2's,3'r和3s,1's,2'r,3's构型。

32、表3化合物3/4(dmso-d6)的1h(400mhz)和13c(100mhz)数据

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34、对发明所述4个新化合物的抗神经炎症活性进行了考察，其中在脂多糖(lps)诱导的小胶质细胞(bv2)模型中，化合物1-4抑制no生成作用与阳性对照药相当，因此本发明所述的新螺吲哚酮类生物碱化合物具有进一步开发预防和治疗神经炎症药物的前景。

35、在第三个方面中，本发明还提供一种药物组合物，包含所述新颖的螺吲哚酮类生物碱化合物1-4或其在药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。

36、在第四个方面中，本发明提供了上述新颖的螺吲哚酮类生物碱化合物或其药学上可接受的盐或者包含其的药物组合物在制备抗神经炎症药物中的应用。

37、或者，本发明提供了上述新颖的螺吲哚酮类生物碱化合物或其药学上可接受的盐或者包含其的药物组合物在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

38、优选地，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏症或帕金森氏症。

39、本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：本发明的优点在于，所述化合物均为新化合物，结构新颖，且均为立体构型确定的光学纯化合物，同时其抗神经炎症活性强，具有进一步开发的价值。