一种同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qPCR引物探针组及其应用

本技术属于生物，具体涉及一种同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组及其应用。

背景技术：

1、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)是一种革兰氏阳性厌氧菌，广泛存在于自然界以及人和动物的胃肠道中，属于条件致病菌，可引起多种人和动物的全身性和胃肠道疾病。其能产生20余种毒素和水解酶，根据产生毒素的不同，产气荚膜梭菌主要分为7种毒素类型，不同的毒素基因型的产气荚膜梭菌对动物的致病机理不同，因此所引起的病程和发病症状也不相同。毒素被肠黏膜吸收并随血液循环扩散到多种组织器官，如心、肝、脾、肺、肾、膀胱、肠组织、淋巴和大脑等中，形成毒血症或败血症，使患病动物全身器官衰竭而死亡。该病病程短、发病急，死亡快为特点，四季均可发病，呈零星式散发或区域性流行。该菌引起的疾病已广泛分布于全国各地，对我国畜牧行业的发展形成了很大的困扰和严重的阻碍。

2、多杀性巴氏杆菌(pasteurellamultocida,p.multocida)是一种革兰阴性条件致病菌，能够感染多种宿主，包括人类、伴侣动物、牲畜和野生动物，是禽霍乱、牛和水牛及家兔出血性败血病的病原菌，该病的发病率和死亡率很高，往往会导致畜牧业巨大的经济损失。

3、目前，对于产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的检测还是采用传统的细菌分离纯化及染色镜检，以及16s rrna基因扩增和测序，这些传统方法在灵敏度、检测效率、重复性及成本等方面还有一定的欠缺，而实时荧光定量pcr技术已经成功应用于病原在诊断于检测，具有高速、自动化程度高、特异性强等优点。

4、当产气荚膜梭菌、多杀性巴氏杆菌混合感染时，难以做出快速准确判断，因此提供一种同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重pcr引物探针组，建立产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌多重qpcr检测方法，为实现快速诊断产气荚膜梭菌毒素基因分型和多杀性巴氏杆菌病及检测病原的荚膜血清学分型提供技术手段具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题是提供一种同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组；本发明所要解决的第二技术问题是提供一种产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr检测方法；本发明所要解决的第三技术问题是提供该产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组的应用。

2、为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，一种同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组，序列分别如seq id no.1至seq id no.30所示。

4、作为本发明的一种优选，一种同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组，包括：

5、用于检测产气荚膜梭菌的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq id no.1至seq id no.15所示；

6、用于检测多杀性巴氏杆菌的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq idno.16至seq id no.30所示。

7、作为本发明的一种优选，一种同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组，包括：

8、用于检测产气荚膜梭菌的cpa毒素基因型的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq id no.1至seq id no.3所示；

9、用于检测产气荚膜梭菌的cpb毒素基因型的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq id no.4至seq id no.6所示；

10、用于检测产气荚膜梭菌的etx毒素基因型的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq id no.7至seq id no.9所示；

11、用于检测产气荚膜梭菌的itx毒素基因型的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq id no.10至seq id no.12所示；

12、用于检测产气荚膜梭菌的cpe毒素基因型的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq id no.13至seq id no.15所示；

13、用于检测多杀性巴氏杆菌荚膜血清a型的hyac-hyad基因的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq id no.16至seq id no.18所示；

14、用于检测多杀性巴氏杆菌荚膜血清b型的bcbd基因的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq id no.19至seq id no.21所示；

15、用于检测多杀性巴氏杆菌荚膜血清d型的dcbf基因的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq id no.22至seq id no.24所示；

16、用于检测多杀性巴氏杆菌荚膜血清e型的ecbj基因的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq id no.25至seq id no.27所示；

17、用于检测多杀性巴氏杆菌荚膜血清f型的fcbd基因的上游引物、下游引物和探针，序列分别如seq id no.28至seq id no.30所示。

18、第二方面，一种同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr试剂，包括所述的多重pcr引物探针组。

19、第三方面，一种含有所述的同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组或所述的同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr试剂的试剂盒。

20、作为本发明的一种优选，所述试剂盒中还包括阳性质控品和阴性质控品。

21、作为本发明的一种优选，阳性质控品为产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的阳性质控品。

22、作为本发明的一种优选，阴性质控品为灭菌的ddh2o。

23、第四方面，所述的同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组或所述的同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr试剂或所述的试剂盒在如下1)至3)中的任一种中的应用：

24、1)制备用于检测产气荚膜梭菌和/或多杀性巴氏杆菌的产品；

25、2)制备用于检测待测微生物是否为产气荚膜梭菌和/或多杀性巴氏杆菌的产品；

26、3)制备用于检测待测样本中是否含有产气荚膜梭菌和/或多杀性巴氏杆菌的产品；

27、4)制备用于对待测样本中产气荚膜梭菌的毒素基因分型和/或多杀性巴氏杆菌的荚膜血清型分型鉴定的产品。

28、作为本发明的一种优选，所述应用为非疾病诊断目的。

29、第五方面，一种同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr方法，包括以下步骤：

30、s1、提取待测样本的dna；

31、s2、配制同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr反应体系，对待测样本的dna进行多重qpcr扩增；

32、s3、根据多重qpcr扩增结果进行鉴定。

33、作为本发明的一种优选，提取待测样本的dna的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的dna提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。

34、作为本发明的一种优选，多重qpcr反应体系包括：2×qpcr supermix、同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组和dna模板。

35、作为本发明的一种优选，多重qpcr反应体系包括：2×qpcr supermix、同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组、dna模板和ddh2o。

36、作为本发明的一种优选，同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组占多重qpcr反应体系中的体积比为0.3～0.4:1。

37、作为本发明的一种优选，同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组占多重qpcr反应体系中的体积比为0.3375:1。

38、作为本发明的一种优选，同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组中，用于检测产气荚膜梭菌的cpa毒素基因型的引物探针组合物、用于检测产气荚膜梭菌的cpb毒素基因型的引物探针组合物、用于检测产气荚膜梭菌的etx毒素基因型的引物探针组合物、用于检测产气荚膜梭菌的itx毒素基因型的引物探针组合物、用于检测产气荚膜梭菌的cpe毒素基因型的引物探针组合物、用于检测多杀性巴氏杆菌荚膜血清a型的引物探针组合物、用于检测多杀性巴氏杆菌荚膜血清b型的引物探针组合物、用于检测多杀性巴氏杆菌荚膜血清d型的引物探针组合物、用于检测多杀性巴氏杆菌荚膜血清e型的引物探针组合物、用于检测多杀性巴氏杆菌荚膜血清f型的上游引物的引物探针组合物的体积比为1:1:1:1:1：1.25:1.25:1.25:1.25:1.25。

39、作为本发明的一种优选，多重qpcr反应的程序为：95℃预变形5min；95℃变性10s，在预定的退火温度下退火、延伸30s，扩增40个循环。

40、作为本发明的一种优选，退火温度为56.5℃～59.0℃。

41、作为本发明的一种优选，退火温度为57.5℃。

42、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

43、(1)本技术的同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr引物探针组，能够减少多重qpcr中引物二聚体和发夹结构的形成。

44、(2)本技术的同时检测产气荚膜梭菌和多杀性巴氏杆菌的多重qpcr方法能够在同一体系中同时检测产气荚膜梭菌的五种毒素基因分型和/或多杀性巴氏杆菌的五种荚膜血清学分型，其灵敏度高，比普通pcr的灵敏度高出至少10倍；特异性高，不同细菌之间无交叉反应；重复性好，变异系数均小于3％；操作简单，一次加样封盖后即可，减少反复开盖带来的污染问题。对临床样本的检测结果更加明了，应用前景广阔。