一种与桑叶芦丁含量相关的SNP分子标记及其应用

本发明涉及桑树分子标记筛选，更具体地，涉及一种与桑叶芦丁含量相关的snp分子标记及其应用。

背景技术：

1、桑叶为桑科植物桑树的叶，可药用，味甘、苦，性寒；归肺、肝经，能疏散风热，清肝明目，清肺润燥，其药用首载于《神农本草经》，《本草经疏》《本草纲目》中也均有记载。我国桑树种质资源丰富，桑叶营养成分多样。桑叶中包含许多活性成分，主要包括蛋白质、生物碱、黄酮、多酚、多糖及氨基酸等，因而具有降血糖、抗炎、抗氧化、降血脂、抗衰老等作用，具有较高的食用价值与药用价值。桑叶已经被国家卫生部正式列入“既是食品又是药品”的植物资源名单。

2、芦丁，又称为芸香苷，分子式为c27h30o16，分子量为610.52，是一种以槲皮素为苷元，以芸香糖为糖基的天然糖苷，母核的基本结构为二苯基色原酮，由3个位于中央的碳原子连接2个具有酚羟基的苯环所构成。

3、芦丁是桑叶黄酮类的主要成分之一。其作用广泛，具有较强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、预防肥胖、保肝等活性功能。芦丁通过降低炎症因子水平、抑制炎症反应中的酶活性或干扰某些信号通路的关键酶的合成和表达等方式来达到抗炎的作用，可用于治疗中性粒细胞介导的炎症、自身免疫性疾病以及肠炎等。2020年首次证实芦丁可以抑制酵母多糖诱导的关节炎小鼠体内中性粒细胞的聚集、抑制关节内肿瘤坏死因子-α的合成来减轻关节炎症。另外，芦丁可以下调nf-κb信号通路来缓解右旋葡聚糖硫酸钠诱导的大鼠溃疡性结肠炎。芦丁被证实具有抗菌活性，但其直接抑菌作用弱于抗菌药物，可协同抗菌药物共同发挥作用，进而减少抗菌药物的使用剂量，减轻细菌耐药性以及药物毒性作用。桑叶芦丁具有一定的抗肥胖作用，能有效地提高棕色脂肪细胞活性，增加机体能量代谢，维持葡萄糖稳态，并改善肝脏脂肪变性，显著降低了遗传肥胖小鼠和饮食诱导肥胖小鼠的脂肪含量，为肥胖及其相关疾病的治疗开辟了一条新的途径，还有文献显示芦丁能通过激活棕色脂肪来改善大鼠的多囊卵巢综合征。芦丁通过清除体内自由基，提高细胞内抗氧化酶的活性，来发挥抗氧化作用，并且桑叶芦丁含量与桑叶抗氧化能力相关性极显著，以芦丁含量为指标可评价桑叶的抗氧化能力。

4、全基因组关联分析(genome wide association study，gwas)是对多个个体在全基因组范围的遗传变异多态性进行检测，获得基因型，进而将基因型与可观测的性状，即表型，进行群体水平的统计学分析，根据统计量或显著性p值筛选出最有可能影响该性状的遗传变异，挖掘与性状变异相关的基因。全基因组关联分析已经被广泛应用于各类研究。近二十年，随着基因组技术的快速发展，测序技术手段的提高，许多动植物的全基因组测序已经完成，gwas已经成为研究多基因控制的复杂性状的重要方法。2005年，开展了植物中的第一次完全意义的gwas研究，学者们通过对拟南芥开花时间和病原菌抗性的研究，验证了gwas在拟南芥中的可行性。此后，随着测序技术和统计模型的快速发展，该方法逐渐广泛地应用于植物中，目前已经在水稻、大豆、玉米、棉花、茶树、苦荞等植物中有报道。芦丁在桑叶中的含量高，且具有多种活性功能，其含量为数量性状，由多基因控制，通过gwas挖掘与芦丁含量相关的重要snp位点，有利于加深对桑树芦丁合成机制的研究，可定向培育芦丁含量高的桑树品种，对于桑叶高值化利用有重要的意义，促进蚕桑产业经济效益的提升。

5、筛选芦丁含量高的优势品种或者培育高产的新品种对于桑树的开发利用有重大意义。目前传统方法判断桑叶芦丁含量高低需要对各样本进行检测，检测方法需要摸索，工作量大且操作比较复杂，例如：周美环等公开了hplc法测定桑叶中芦丁的含量(周美环,赵书楷,陈淼,等.hplc法测定桑叶中芦丁的含量[j].辽宁中医药大学学报,2010,12(5):2.)，目前还缺少与芦丁含量相关的生物分子标记。筛选与桑叶芦丁含量的相关性的snp位点并用于检测，以期提供一种简单、快速筛选芦丁含量高的优势品种或者培育高产的新品种的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种与桑叶芦丁含量相关的snp分子标记。

2、本发明的第二个目的在于提供所述snp分子标记的应用。

3、本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

4、本发明使用高效液相色谱测定203份桑树种质资源桑叶中芦丁含量，基于变异检测的snp数据，经过质控，获得次要等位基因频率≥0.05和位点完整度≥0.8的高一致性snp位点作为基因型，使用gemma、fast-lmm、emmax 3款软件，以桑叶芦丁含量为表型，结合基因型数据，进行gwas，最终每个变异位点都能得到一个关联结果。计算得到的p值进一步绘制曼哈顿图(manhattan plot)和q-q图(quantile-quantile plot)。根据p值筛选与桑叶芦丁相关的snp位点lg07 18558176，为芦丁含量的相关育种提供了新的分子标记资源和应用。

5、因此，本发明首先提供一种与桑叶芦丁含量相关的snp分子标记，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，第51位核苷酸存在t/c多态性位点。

6、具体核苷酸序列如下所示：

7、

8、本发明基于203份桑树种质资源重测序数据，对桑叶芦丁含量进行gwas，得到lg0718558176上下游50bp的核苷酸序列，其核苷酸序列seq id no.1所示，其序列第51位的r是突变位点，由等位基因t突变为等位基因c，该突变使上述序列即seq id no.1所述的序列产生了核苷酸多态性，当序列的第51位核苷酸为c时，桑叶芦丁含量较低；当桑树基因型为等位基因t纯合(tt)时，桑叶芦丁含量较高，由此得到了一种与桑叶芦丁含量相关的snp分子标记。所述snp分子标记可用于桑树的分子标记辅助育种，在早期可以直接在基因组水平上选育个体，不依赖表型信息，可显著提高选择效率，加快育种进程，缩短选育时间，提高了育种效率，降低了育种成本，具有广泛的应用前景。

9、因此，本发明还提供所述snp分子标记在判定桑叶芦丁含量中的应用。

10、本发明还提供用于检测上述snp分子标记核苷酸多态性的试剂在判定桑叶芦丁含量中的应用。

11、所述检测上述snp分子标记核苷酸多态性的试剂为采用本领域常规的检测snp分子标记核苷酸多态性技术的试剂，包括但不限于采用测序法、taqman探针法、arms-pcr法、分子信标法、高分辨率熔解曲法、caps法、snapshot法、kasp法或基因芯片法等。例如基因芯片(gene chip)是指将大量针对snp的寡核苷酸探针高密度地固定在一固相支持物表面，从而形成多重寡核苷酸微阵列，而经荧光染料标记后的待测dna片段，与芯片上固定好的探针阵列进行杂交反应，核酸片段只与其序列完全互补配对的探针杂交，不与含有单个错配碱基的序列杂交，从而将目标序列固定下来，再通过清洗去除非目标片段，最后通过扫描检测芯片上的荧光信号，由此确定snp位点。另外，也可将寡核苷酸引物的5’末端固定在固相支持物上，而让其3’末端作为引物进行延伸反应，且反应体系中使用ddntp作为原料，因此只能延伸1个碱基，这个被延伸的碱基与snp位点碱基互补结合，由此可通过检测芯片上的荧光信号确定snp位点。

12、一种用于判定桑叶芦丁含量的方法，以待测桑叶或待测桑叶基因组dna为模板，检测上述snp分子标记的核苷酸多态性，当seq id no.1所示序列上的第51位核苷酸为c时，判定桑叶芦丁含量较低；当为等位基因t纯合tt时，判定桑叶芦丁含量较高。

13、进一步地，所述桑叶芦丁含量较低是指桑叶芦丁含量低于1.7mg/g；所述桑叶芦丁含量较高为3.64±1.71mg/g。

14、本发明还提供所述分子标记在制备判定桑叶芦丁含量的产品中的应用。

15、本发明还提供用于检测上述snp分子标记核苷酸多态性的试剂在制备判定桑叶芦丁含量的产品中的应用。

16、本发明还提供一种用于判定桑叶芦丁含量的产品，所述产品包含用于检测上述snp分子标记核苷酸多态性的试剂。

17、本发明还提供所述snp分子标记在桑树辅助育种中的应用。

18、本发明还提供用于检测上述snp分子标记核苷酸多态性的试剂在桑树辅助育种中的应用。

19、本发明还提供上述产品在桑树辅助育种中的应用。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、本发明公开了一种与桑叶芦丁含量相关的snp分子标记，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，第51位核苷酸存在t/c多态性位点，当序列的第51位核苷酸为c时，判定桑叶芦丁含量较低；当桑树基因型为等位基因t纯合(tt)时，判定桑叶芦丁含量较高。所述snp分子标记可用于桑树的分子标记辅助育种，在早期可以直接在基因组水平上选育个体，不依赖表型信息，可显著提高选择效率，加快育种进程，缩短选育时间，提高了育种效率，降低了育种成本。