一种重组变体mFGF21蛋白、修饰蛋白及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种重组变体mfgf21蛋白、修饰蛋白及其制备方法与应用，进一步涉及重组变体mfgf21蛋白及其修饰蛋白在制备用于预防、缓解和/或治疗肺纤维化药物中的应用，特别涉及重组变体mfgf21蛋白及其修饰蛋白在在制备用于预防、缓解和/或治疗特发性肺纤维化药物中的应用。

背景技术：

1、特发性肺纤维化是以成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积为特征的肺部疾病。美国胸科学会、欧洲呼吸学会等重新定义了特发性肺纤维化，并指出特发性肺纤维化是弥漫性间质性肺病中的一种特殊类型，是一种不可逆纤维化、原因不明、发生于成人、局限于肺及进行性纤维化的间质性肺炎。特发性肺纤维化病情呈进行性发展，预后差，死亡率高，约60％患者死亡原因是肺部病变的进展，死于呼吸衰竭，特发性肺纤维化诊断后中位存活时间2-3年。近年来，环境污染日益严重，雾霾等天气的频发导致特发性肺纤维的发病率显著增加，对人们的生命健康产生了严重威胁。特发性肺纤维化治疗目标是阻断疾病进展，延长生存期，预防急性发作，减轻症状。目前针对特发性肺纤维化的药物治疗，如2015年国际指南推荐的吡非尼酮、尼达尼布。吡非尼酮降低细胞增殖、纤维化相关蛋白的产生和细胞外基质的合成和聚集，减少多种刺激引起的炎症细胞聚集；尼达尼布是一种酪氨酸激酶抑制剂，阻滞细胞内信号传导，抑制成纤维细胞的增殖、迁移和转化。临床证据显示这两种药物对特发性肺纤维化患者均有较好的疗效，能够延缓肺功能下降、改善患者生活质量，但其不良反应多见，不能阻止疾病进展，无法延长患者的生存期。除此之外，仅有肺移植手术可以逆转其病程。因此，针对特发性肺纤维化开发安全性高，疗效好的生物蛋白类制剂是目前治疗肺纤维化的重点。

2、成纤维细胞生长因子21(fgf21)是fgf家族的新成员，是一种可分泌蛋白。fgf21主要在肝脏、脂肪、骨骼肌、胰腺等组织器官中表达。fgf21不具有成纤维细胞营养活性，主要作用是调节糖脂代谢，具有增加胰岛素的敏感性、改善胰岛b细胞功能、降低三酰甘油水平、改善与肥胖相关的高糖、高脂血症及减轻体质量等功能，与代谢性疾病及心血管疾病密切相关。fgf21安全、有效、不会产生低血糖和引起肿瘤发生等副作用，使其有望成为治疗糖尿病及相关疾病的新型药物。2012年fgf-21被开发成减肥药以及治疗糖尿病药物，并且该药物已经进入了临床试验阶段。2013年科学家报道了fgf21已通过了i期临床，其安全性得到了认可。

3、相关研究表明，野生型fgf21通过激活nrf-2途径抑制肺纤维化，但是存在抑制效果不佳等问题。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种重组变体mfgf21蛋白、修饰蛋白及其制备方法与应用。通过基因工程技术、修饰技术得到的重组变体mfgf21蛋白、修饰的重组变体mfgf21蛋白(peg-mfgf21)在小鼠特发性肺纤维化中具有较好的疗效，并且效果显著高于野生型fgf21(wt-fgf21)。

2、本发明的第一个目的在于提供一种重组变体mfgf21蛋白。

3、所述重组变体mfgf21蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。

4、重组变体mfgf21蛋白的氨基酸序列(seq id no:2)：adsspllqfggqvrqrylytddarqteahleiredgtvggaadqspesllqlralapgviqilgvhtprflcqrpdgalygslhfdpeacsfrellledgynvyqseahglplhlpgnrsphrdpaprgparflplpflppalpeppgilgpqppdvgssdplsmvgpsqgrspsyas

5、本发明的第二个目的在于提供编码上文所述的重组变体mfgf21蛋白的核酸分子。

6、所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:1所示。

7、重组变体mfgf21蛋白的核苷酸序列(seq id no:1)：gcagactcctccccactgctgcaatttggtggtcaagtacgtcagcgttacctgtataccgatgacgcgcgccagaccgaagcccacctggaaattcgcgaagatggcaccgttggcggtgcagctgaccagtctccggaatccctgctgcagctgcgtgcgctggcccctggtgtaatccagatcctgggtgtccacactccgcgtttcctgtgtcagcgtccagatggcgctctgtacggctctctgcacttcgaccctgaagcgtgcagctttcgcgagctgctgctggaggatggctacaacgtttaccagtccgaggcacacggtctgccgctgcacctgcctggcaaccgttctccgcaccgcgacccagccccgcgtggcccggcacgttttctgcctctgccgttcctgcctccagcactgccggagccgccaggtattctgggccctcagccgcctgacgtgggcagctctgatccactgtccatggtgggcccttcccagggccgttccccttcctacgcctct

8、本发明的第三个目的在于提供一种重组变体mfgf21蛋白的制备方法。

9、所述制备方法包括：

10、将如seq id no:1所示的核酸分子与表达载体连接并转化至宿主细胞中，经发酵处理、破碎处理，得到重组变体mfgf21蛋白；

11、在一些实施方案中，所述表达载体为pet30a或pet28a；所述宿主细胞为大肠杆菌。

12、在一些实施方案中，所述发酵处理包括：接种量为5-20％，诱导的od600nm值为5-10，iptg浓度为0.5-2mm，诱导温度18-37℃，诱导时间为3-8h。

13、本发明中，发明人对发酵参数进行优化，显著地提高目标蛋白的表达量。

14、在一些实施方案中，所述破碎处理包括：使用高压均质机对发酵后的宿主细胞进行破碎，在一些优选的实施方案中，破碎三次，在一些更优选的实施方案中，第一次破碎压力为500-600bar，第二次和第三次破碎压力为700-800bar。

15、在一些优选的实施方案中，所述制备方法还包括对所述重组变体mfgf21蛋白进行纯化的步骤。

16、在一些更优选的实施方案中，所述重组变体mfgf21蛋白进行纯化的步骤包括：首先采用中空纤维式、卷式膜、管式膜或板框式膜中的一种或多种对经破碎处理后得到的包涵体进行洗涤、变性、复性；然后采用离子交换柱对复性后的样品进行纯化，经浓缩和缓冲液置换，得到高纯度的重组变体mfgf21蛋白。

17、较佳地，所述洗涤和所述变性所用膜孔径为0.05-0.6μm，所述复性所用膜孔径为3-10kd。

18、本发明中，采用切向流膜分离技术对包涵体进行洗涤、变性和复性，显著地提高目标蛋白的产率，同时利用离子交换柱对目标蛋白进行纯化，进一步提高目标蛋白的纯度。

19、本发明的第四个目的在于提供一种修饰的重组变体mfgf21蛋白。

20、所述修饰的重组变体mfgf21蛋白是上文所述的重组变体mfgf21蛋白或上文所述制备方法制备得到的重组变体mfgf21蛋白的化学修饰产物。

21、本发明的第五个目的在于提供一种修饰的重组变体mfgf21蛋白的制备方法。

22、所述制备方法包括：

23、将上文所述的重组变体mfgf21蛋白或上文所述的制备方法制备得到的重组变体mfgf21蛋白与peg修饰剂混合反应，得到修饰的重组变体mfgf21蛋白；

24、在一些优选的实施方案中，所述反应的温度为4-30℃，反应时间为2-24h；

25、在一些优选的实施方案中，所述制备方法还包括对所述修饰的重组变体mfgf21蛋白进行纯化的步骤。

26、在一些更优选的实施方案中，所述修饰的重组变体mfgf21蛋白进行纯化的步骤包括：采用离子交换柱对样品进行纯化，经浓缩和缓冲液置换，得到高纯度的修饰的重组变体mfgf21蛋白。

27、在一些实施方案中，所述重组变体mfgf21蛋白与所述peg修饰剂的摩尔比为1:2-1:6，在一些优选的实施方案中，所述重组变体mfgf21蛋白在混合反应体系中的终浓度为8-12mg/ml；和/或，

28、所述peg修饰剂的分子量为10-40kd，在一些优选的实施方案中，所述peg修饰剂的分子量为20kd；和/或，

29、所述peg修饰剂为聚乙二醇醛类，在一些优选的实施方案中，所述peg修饰剂为聚乙二醇丙醛。

30、本发明中，修饰的重组变体mfgf21蛋白的制备方法可提高修饰剂修饰目的蛋白修饰工艺及纯化工艺的可控性，保证修饰物产率及均一性，提高整体工艺中目的蛋白收率及产量。

31、本发明的第六个目的在于提供上文所述的重组变体mfgf21蛋白、上文所述的制备方法制得的重组变体mfgf21蛋白、上文所述的修饰的重组变体mfgf21蛋白、上文任一项所述的修饰的重组变体mfgf21蛋白的制备方法制得的修饰的重组变体mfgf21蛋白在制备用于预防、缓解和/或治疗肺纤维化疾病、肾纤维化疾病、肝纤维化疾病、心肌炎疾病、脂代谢疾病、非酒精性脂肪肝疾病的药物中的应用；在一些优选的实施方案中，所述肺纤维化疾病为特发性肺纤维化疾病。

32、在一些实施方案中，所述预防、缓解和/或治疗中，所述重组变体mfgf21蛋白或所述修饰的重组变体mfgf21蛋白的有效剂量为0.1～10mg/kg，药效持续时间为1～7d；和/或，

33、所述预防、缓解和/或治疗中，所述重组变体mfgf21蛋白或所述修饰的重组变体mfgf21蛋的给药途径包括口服、腹腔注射、皮下注射、静脉注射或肌肉注射。

34、本发明的第七个目的在于提供一种用于预防、缓解和/或治疗特发性肺纤维化的药物。

35、在一些实施方案中，所述药物的活性成分包括上文所述的重组变体mfgf21蛋白、上文所述的制备方法制备得到的重组变体mfgf21蛋白、上文所述的修饰的重组变体mfgf21蛋白、上文所述的修饰的重组变体mfgf21蛋白的制备方法制得的修饰的重组变体mfgf21蛋白中的一种或多种；和/或，

36、所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料；和/或，

37、所述药物的给药途径包括口服、腹腔注射、皮下注射、静脉注射或肌肉注射。

38、本发明的第八个目的在于提供上文所述的核酸分子作为药物靶标在筛选具有治疗特发性肺纤维化的药物中的应用。

39、在一些优选的实施方案中，所述药物为重组变体mfgf21蛋白的小分子激活剂。

40、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

41、1)本发明制得的重组变体mfgf21蛋白和修饰的重组变体mfgf21蛋白(peg-mfgf21)具有活性更高，药效更佳的特点；与野生型fgf21蛋白相比，同剂量的mfgf21蛋白和修饰的重组变体mfgf21蛋白改善肺纤维化的效果更好；

42、2)本发明通过对发酵条件进行优化，结合切向流膜分离和层析技术，发展了一种低成本、高表达、高产率的发酵和纯化体系，获得了高纯度的重组变体mfgf21蛋白；同时采用定点修饰技术，蛋白修饰效率高，解决多修饰和非特异性修饰的问题，得到的修饰的重组变体mfgf21蛋白(peg-mfgf21)质量稳定可控，整体制备工艺稳定性好，可实现稳定的工艺放大；

43、3)本发明制备得到的修饰的重组变体mfgf21蛋白(peg-mfgf21)具有安全性好，药效持续时间长等特点，在降低给药频率的同时，仍可以显著改善肺纤维化的进展，抑制胶原沉积，对于特发性肺纤维化的治疗具有重大的意义。