肺炎克雷伯菌的FimA的抗原表位肽及其应用

本发明涉及医学及免疫，具体涉及一种肺炎克雷伯菌的fima的抗原表位肽及其应用。

背景技术：

1、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，简称kp)是医院获得性感染中较常见和重要的病原菌之一，其感染可致严重的系统性和多器官感染，也是全球常见的耐药菌株。chinet中国细菌耐药监测网2020年数据显示，临床感染样本中分离的病原菌中，肺炎克雷伯菌居于第2位(13.86％)，并呈逐年上升趋势，其对第三代头孢菌素耐药率超30％。我国肺炎克雷伯菌感染的病例平均死亡率为15.2％-27.8％。

2、根据其毒力及致病特点，肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，kp)可分为普通肺炎克雷伯菌(classic klebsiellapneumonia，ckp)和高毒力肺炎克雷伯(hypervirulentklebsiellapneumonia，hvkp)，其中hvkp因其高黏液性更易引起健康人群及青年人群患病。近年来，由于高侵袭性和高毒性的细菌如耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的广泛流行，已成为对公共卫生的主要威胁，其耐药形势也十分严峻，并且耐药机制复杂多样，包括产β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶、染色体变异、质粒及整合子介导、外膜孔蛋白缺失、靶位改变、生物膜形成及主动外排机制等。使得抗生素治疗难上加难，寻找新的非抗生素疗法已迫在眉睫，而疫苗不受抗生素耐药性的影响，通过免疫学角度着手，研发安全有效的疫苗成为非常有潜力的控制策略。而目前尚没有获得认证的肺炎克雷伯菌疫苗。解析肺炎克雷伯菌重要抗原诱发保护性应答的有效成分及其免疫应答机制，是解决该科学问题的基础和前提。

3、尽管肺炎克雷伯菌具有多种毒力因子发挥致病作用，但肺炎克雷伯菌致病的前提是能够在患者体内定植，后生长侵袭并致病。菌毛是革兰阴性细菌表面的一种突起结构，具有极强的黏附活性，将肺炎克雷伯菌黏附在宿主细胞表面，引发感染并致病。ⅰ型菌毛含有fima、b、c、d、e和h等多种蛋白，其中，fima为主要结构蛋白，占ⅰ型菌毛总蛋白的95％以上。fima蛋白能刺激宿主分泌炎症因子，参与黏附以及抑制细胞凋亡，同时有研究证实ⅰ型菌毛是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌尿路感染的关键因素，肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌的i型菌毛结构高度相似，其主要组成成分都是fima蛋白。研究证实，针对fima蛋白的单克隆抗体能阻止牙龈卟啉单胞菌黏附，起保护宿主的作用。这提示，fima是抗肺炎克雷伯菌感染潜在的保护性抗原。

4、大量的报道证实，抗体应答在抗肺炎克雷伯菌感染中发挥重要保护作用。由于蛋白抗原发挥其功能主要通过其中的表位来体现特异性，其中发挥主要作用的是“免疫优势”表位。因此，fima抗原中免疫优势应答的保护性表位的鉴定，是提升和优化基于fima抗原的肺炎克雷伯菌疫苗设计的重要前提。筛选fima的免疫优势表位，是激发更有效的fima免疫应答的前提。目前的已知的fima的b细胞表位，或通过生物信息学软件推测，或使用人或动物免疫模型中鉴定，尚未有关于在不同免疫途径中全面筛选参与免疫应答的fima的“优势表位”的报道。由于现有的人群免疫疫苗佐剂主要有铝佐剂(如al(oh)3)及mf59等，因此，亟需建立一种准确有效的筛选及鉴定在铝佐剂下参与免疫应答的fima的b细胞“优势表位”的方法。

技术实现思路

1、针对上述需求，本发明提供了一种肺炎克雷伯菌的fima的抗体优势表位肽的鉴定方法，以及该表位肽在制备用于诊断、预防和/或治疗肺炎克雷伯菌感染的药物中的应用。

2、本发明首先提供了一种肺炎克雷伯菌fima蛋白的抗原表位肽，其包含至少一个抗原优势表位，所述抗原优势表位的氨基酸序列为seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19或seq id no:25。

3、在根据本发明的一个实施方案中，所述抗原表位肽n端或c端偶联有多肽标记；优选地，所述多肽标记为生物素标记或荧光标记。

4、本发明进一步提供了所述的抗原表位肽在制备用于诊断肺炎克雷伯菌感染的诊断试剂中的用途，以及述的抗原表位肽在制备用于预防或治疗肺炎克雷伯菌感染的疫苗中的用途。

5、本发明还提供了一种用于预防或治疗肺炎克雷伯菌感染的药物组合物，其包含上述的抗原表位肽和药学上可接受的辅料；优选地，还包含与所述抗原表位肽偶联的载体蛋白，所述载体蛋白为血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,klh)，牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,bsa)或鸡卵白蛋白(ovalbumin,ova)。

6、在根据本发明的一个实施方案中，所述药物组合物还包含佐剂，所述佐剂选自al(oh)3、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、addavax；所述佐剂优选为al(oh)3。

7、在根据本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为经鼻施用的剂型；优选为喷雾剂、滴鼻剂、粉末剂、凝胶制剂或微球制剂。

8、本发明进一步提供了一种用于诊断肺炎克雷伯菌感染的诊断试剂，其包含上述的抗原表位肽，所述抗原表位肽包被于检测载体上，所述检测载体选自聚苯乙烯微量反应板、胶体金试剂条、磁珠和微流控芯片中的任一种。

9、在根据本发明的一个实施方案中，还包含特异性识别所述抗原表位肽的第一抗体，所述第一抗体为鼠源抗体；优选地，所述第一抗体是通过以所述抗原表位肽免疫小鼠或大鼠后，分离获得的多克隆抗体，或者，基于免疫后小鼠或大鼠的b淋巴细胞进一步制备得到的单克隆抗体。

10、在根据本发明的一个实施方案中，所述诊断试剂还包含特异性识别鼠igg抗体的第二抗体；

11、优选地，所述第二抗体选自羊抗鼠单克隆抗体、兔抗鼠多克隆抗体中的一种；

12、优选地，所述第二抗体偶联有激活或猝灭所述特异性荧光基团的配合基团。

13、本发明的上述技术方案的有益效果如下：

14、本发明提供的fima蛋白的抗原表位肽具有明显地抗肺炎克雷伯君感染的效应，能够用于制备预防肺炎克雷伯菌感染的高效、低毒、高安全性的基于fima的药物，如预防型疫苗。

15、本发明提供的肺炎克雷伯菌的fima的抗体优势表位肽具有抗肺炎克雷伯菌感染的效应，用该优势表位免疫动物，免疫制剂无无关成分或有害成分，以该抗体优势表位肽制备的特异性单克隆抗体可以较好地的预防肺炎克雷伯菌感染。

16、经序列比对分析，本发明提供的肺炎克雷伯菌的fima的抗体优势表位肽在多种肺炎克雷伯菌毒株中序列保守，因此，其也可用作肺炎克雷伯菌的诊断试剂或用于对其他肺炎克雷伯菌感染的预防和治疗。

技术特征：

1.一种肺炎克雷伯菌fima蛋白的抗原表位肽，其特征在于，包含至少一个抗原优势表位，所述抗原优势表位的氨基酸序列为seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19或seqid no:25。

2.如权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽n端或c端偶联有多肽标记；优选地，所述多肽标记为生物素标记或荧光标记。

3.如权利要求1或2所述的抗原表位肽在制备用于诊断肺炎克雷伯菌感染的诊断试剂中的用途。

4.如权利要求1或2所述的抗原表位肽在制备用于预防或治疗肺炎克雷伯菌感染的疫苗中的用途。

5.一种用于预防或治疗肺炎克雷伯菌感染的药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的抗原表位肽和药学上可接受的辅料；优选地，还包含与所述抗原表位肽偶联的载体蛋白，所述载体蛋白为血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,klh)，牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,bsa)或鸡卵白蛋白(ovalbumin,ova)。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，还包含佐剂，所述佐剂选自al(oh)3、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、addavax；所述佐剂优选为al(oh)3。

7.如权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为经鼻施用的剂型；优选为喷雾剂、滴鼻剂、粉末剂、凝胶制剂或微球制剂。

8.一种用于诊断肺炎克雷伯菌感染的诊断试剂，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的抗原表位肽，所述抗原表位肽包被于检测载体上，所述检测载体选自聚苯乙烯微量反应板、胶体金试剂条、磁珠和微流控芯片中的任一种。

9.如权利要求8所述的诊断试剂，其特征在于，还包含特异性识别所述抗原表位肽的第一抗体，所述第一抗体为鼠源抗体；优选地，所述第一抗体是通过以所述抗原表位肽免疫小鼠或大鼠后，分离获得的多克隆抗体，或者，基于免疫后小鼠或大鼠的b淋巴细胞进一步制备得到的单克隆抗体。

10.如权利要求7所述诊断试剂，其特征在于，还包含特异性识别鼠igg抗体的第二抗体；

技术总结
本发明提供了一种肺炎克雷伯菌的FimA的抗原表位肽，包含氨基酸序列为SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:25的抗原优势表位。本发明提供的抗原势表位肽偶联蛋白主动免疫具有预防肺炎克雷伯菌感染的效应，可以用于制备预防肺炎克雷伯菌感染的高效、低毒、高安全性的基于FimA的药物。

技术研发人员：赵卓,章金勇,明光阳,邹全明,陈致富,苟强,袁月,陈龙龙,敬海明,李思思
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15