基于TGF-beta抗体的陷阱受体的制作方法

本发明涉及生物，具体地涉及一种陷阱受体及其用途。

背景技术：

1、在肿瘤过继细胞治疗中(act)，免疫系统的稳定性至关重要。反应过低可能造成严重感染，反应过强则发生过敏反应。人体免疫系统进化出精细、复杂的双向免疫调节机制对免疫应答进行正负双向调节。在排除外来抗原异物时，激活并加强免疫应答反应；外来抗原物质排除后，可使免疫应答减弱至终止。在肿瘤act中，效应t细胞的正向调节分子包括cd3/tcr复合物、cd28、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)等，负向调节分子包括pd-1(pdcd1、cd279)、ctla-4(cd152)、lag3(cd223)、tim3(havcr2)等。然而在肿瘤微环境(tme)中，存在许多能负调控t细胞免疫应答的因素，使肿瘤细胞得以逃脱肌体免疫系统的监控与清除并不断恶性增殖、侵袭与转移。

2、tgf-β对全身免疫系统具有抑制作用并且抑制宿主的免疫监控。tgf-β在肿瘤的起始与进展中起到重要的作用。tgf-β具有肿瘤促进效果，其通常在多类肿瘤中大量产生并已知具有致癌作用，并且其对肿瘤免疫具有负面影响且显著抑制宿主的肿瘤免疫监控。tgf-β通过抑制编码多个关键蛋白的基因的转录显著地并直接地抑制细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的细胞毒性程序(cytotoxic program)，这些关键蛋白至少包括：穿孔素、颗粒酶a、颗粒酶b、fas配体和g干扰素等细胞毒素。同时，tgf-β对cd4+t细胞的分化与功能也有显著影响。

3、针对免疫效应细胞负调控的tgf-β抑制性信号通路，cn110709416a公开了一种tgf-β诱饵受体，其包括tgf-β结合区结构域和脂质锚定区。tgf-β结合区结构域包含tgf-β受体(如tgf-βrii)。该诱饵受体缺乏跨膜区和胞内区，结合tgf-β因子后无下游的抑制性信号通路激活，减少了tgf-β对免疫效应细胞的抑制作用。为刺激免疫效应细胞的增殖和提升其肿瘤免疫的效果，目前仍然需要更多的包括功陷阱受体在内的手段对免疫效应细胞进行改造。

技术实现思路

1、本发明提供一种分离的融合蛋白，包含：作为胞外区的抗tgf-beta抗体或其抗原结合片段或突变体；跨膜区或gpi锚定区或其突变体。所述融合蛋白不包含共刺激信号分子的胞内结构域或胞内信号转导区域。

2、在一个或多个实施方案中，所述抗tgf-beta抗体为抗tgf-beta1抗体、抗tgf-beta2抗体或抗tgf-beta3抗体。

3、在一个或多个实施方案中，所述抗体包括选自单链抗体(scfv)、单域抗体(sdab)、纳米抗体(nanobody)、重链抗体(hcab)、fab、fab’和f(ab’)2中的任一种或多种。

4、在一个或多个实施方案中，所述抗体具有如下hcdr：

5、hcdr1包含seq id no:48所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:49所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:50所示的氨基酸序列。

6、在一个或多个实施方案中，所述抗体具有如下lcdr：

7、lcdr1包含seq id no:51所示的氨基酸序列，lcdr2包含seq id no:52所示的氨基酸序列，lcdr3包含seq id no:53所示的氨基酸序列。

8、在一个或多个实施方案中，所述抗体的vh的氨基酸序列如seq id no:46所示。

9、在一个或多个实施方案中，所述抗体的vl的氨基酸序列如seq id no:47所示。

10、在一个或多个实施方案中，所述抗体为seq id no:4所示的单链抗体。

11、在一个或多个实施方案中，所述跨膜区包括来自cd28、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、lck、icos、dap10、siglec-9、siglec-10、siglec-15、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、il-2r、il-4r、il-7r、il-10r、il-12r、il-15r、il-21r、cd27和cd40的跨膜区中的任一种或多种。在一个或多个实施方案中，所述il-2r、il-4r、il-7r、il-10r、il-12r、il-15r、il-21r是各自的alpha、beta或gamma亚基。优选地，所述跨膜区是cd28或il7ralpha的跨膜区。

12、在一个或多个实施方案中，所述cd28跨膜区的氨基酸序列如seq id no:8所示。

13、在一个或多个实施方案中，所述il-7ralpha跨膜区的氨基酸序列如seq id no:10所示。

14、在一个或多个实施方案中，所述gpi锚定区包括选自以下的一种或多种蛋白或其gpi锚定结构域：cd44、cd56、cd73、cd55、thy1、ache、iap、alpp、cd59、cd14、cd16、cd24、cd28、cd48、cd52、cd58、cd66a、cd66c、cd66d、cd66e、cd67、cd87、cd108、cd157、upar、jmh蛋白、gdnfr、cntfr、tag-1、prp、磷脂酰肌醇蛋白、信号素7、cea、gfr、ly6g、转铁蛋白受体、接触素(f3)和t-钙黏蛋白。优选地，所述gpi锚定区为cd52蛋白、cd48蛋白、cd55蛋白、alpp蛋白、cd90蛋白或它们的gpi锚定结构域。

15、在一个或多个实施方案中，cd52蛋白的gpi锚定结构域的氨基酸序列如seq idno:12所示，cd48蛋白的gpi锚定结构域的氨基酸序列如seq id no:14所示，cd55蛋白的gpi锚定结构域的氨基酸序列如seq id no:16所示，alpp蛋白的gpi锚定结构域的氨基酸序列如seq id no:18所示，cd90蛋白的gpi锚定结构域的氨基酸序列如seq id no:20所示。

16、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白的胞外区是抗tgf-beta抗体的单链抗体(scfv)，所述单链抗体：

17、(1)具有如下cdr：hcdr1：seq id no:48，hcdr2：seq id no:49，hcdr3：seq id no:50，lcdr1：seq id no:51，lcdr2：seq id no:52，lcdr3：seq id no:53，

18、(2)具有如下可变区：vh：seq id no:46，vl：seq id no:47，或

19、(3)如seq id no:4所示，

20、并且，

21、所述跨膜区包括来自cd28、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、lck、icos、dap10、siglec-9、siglec-10、siglec-15、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、il-2r、il-4r、il-7r、il-10r、il-12r、il-15r、il-21r、cd27和cd40的跨膜区中的任一种或多种，

22、所述gpi锚定区包括选自以下的一种或多种蛋白或其gpi锚定结构域：cd44、cd56、cd73、cd55、thy1、ache、iap、alpp、cd59、cd14、cd16、cd24、cd28、cd48、cd52、cd58、cd66a、cd66c、cd66d、cd66e、cd67、cd87、cd108、cd157、upar、jmh蛋白、gdnfr、cntfr、tag-1、prp、磷脂酰肌醇蛋白、信号素7、cea、gfr、ly6g、转铁蛋白受体、接触素(f3)和t-钙黏蛋白。

23、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白包含seq id no:4所示的单链抗体，和，seq id no:8所示的cd28跨膜区、seq id no:10所示的il7ralpha跨膜区或seq id no:12所示的cd52的gpi锚定结构域。

24、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白还包括位于抗tgf-beta抗体或其抗原结合片段或突变体的n端或c端的膜表面标签。优选地，所述膜表面标签包括bcma胞外结构域或其变体。优选地，bcma胞外结构域的氨基酸序列如seq id no:22所示。

25、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签还包括位于bcma胞外结构域或其变体的n端或c端的接头或铰链区。

26、在一个或多个实施方案中，所述接头的氨基酸序列如seq id no:24或26所示。

27、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白还包括信号肽。优选地，所述信号肽是cd8信号肽、tbrii信号肽或cd52信号肽。

28、本发明还提供一种多核苷酸分子，选自：编码本发明任一实施方案所述的融合蛋白的多核苷酸分子或互补序列。

29、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，抗tgf-beta抗体的编码序列如seqid no:3所示。

30、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，跨膜区是cd28跨膜区，其编码序列如seq id no:7所示。

31、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，跨膜区是il7ralpha跨膜区，其编码序列如seq id no:9所示。

32、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，gpi锚定区是cd52的gpi锚定结构域，其编码序列如seq id no:11所示。

33、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，gpi锚定区是cd48的gpi锚定结构域，其编码序列如seq id no:13所示。

34、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，gpi锚定区是cd55的gpi锚定结构域，其编码序列如seq id no:15所示。

35、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，gpi锚定区是alpp的gpi锚定结构域，其编码序列如seq id no:17所示。

36、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，gpi锚定区是cd90的gpi锚定结构域，其编码序列如seq id no:19所示。

37、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白包含膜表面标签，所述膜表面标签包含编码序列如seq id no:21所示的bcma胞外结构域。

38、在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸分子选自seq id no:31-45和seq idno:54-55中任一所示，或者为任一所示多核苷酸分子的互补序列。

39、本发明还提供一种核酸构建体，含有本发明任一实施方案所述的多核苷酸分子。

40、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体为载体；包括病毒载体或非病毒载体，优选为非病毒载体。

41、在一个或多个实施方案中，所述载体为表达载体或整合载体。

42、本发明还提供一种基因工程化的细胞，其表达本发明任一实施方案所述的融合蛋白，和/或携带所述融合蛋白的编码序列。

43、在一个或多个实施方案中，所述细胞为免疫细胞。

44、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞包括t细胞、dn t细胞、nk细胞、car-t、car-nk、tcr-t、cik、nkt和til。

45、在一个或多个实施方案中，所述细胞还表达car，或携带car的编码序列。

46、在一个或多个实施方案中，所述细胞还表达外源tcr，或携带外源tcr的编码序列。

47、本发明还提供分选表达所述融合蛋白的细胞的方法，包括检测细胞表面的所述抗tgf-beta抗体或其抗原结合片段或突变体或所述膜表面标签。

48、本发明还提供药物组合物，包含药学上可接受的辅料或本发明任一实施方案所述的融合蛋白、多核苷酸分子、核酸构建体以及基因工程化细胞。所述药物组合物用于治疗或预防癌症。

49、在一个或多个实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。

50、本发明还提供本发明任一实施方案所述的融合蛋白、多核苷酸分子、核酸构建体以及基因工程化细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的用途。

51、本发明优点：与已经公开的常规的tgf-β陷阱受体相比，本发明的基于tgf-β抗体的陷阱受体与tgf-β因子亲和力更高，能更好地捕获肿瘤细胞分泌的tgf-β因子，减少免疫效应细胞所受到的抑制作用，提升免疫效应细胞的激活水平；并且跨膜区采用gpi蛋白膜表面锚定序列，能通过脂筏带来的聚集效应进一步提升上述效果。