一种基于微珠测序的基因芯片编解码方法及基因芯片与流程

本发明涉及基因芯片，具体涉及一种基于微珠测序的基因芯片编解码方法及基因芯片。

背景技术：

1、基因芯片技术最成熟的结构形式为微珠芯片，其包括微珠和与微珠连接的探针分子，探针分子上靠近微珠的一段为标签序列，标签序列具有特异性，标签序列的设计即为编码；连接有探针分子的微珠装载到芯片上后，由于装载过程具有随机性，需采取某种方法来获取芯片上每个微珠所对应的探针种类信息，即获取每个微珠的标签序列信息，这一过程即为解码。

2、传统的基因芯片编解码方法采用互补杂交的原理进行。具体地，利用碱基互补配对原理，使微珠上探针的标签序列与其互补序列（解码序列）进行杂交反应，由于解码序列上带有荧光基团，微珠上就带上了相应的荧光信号，通过荧光扫描获取荧光信号，再转换成对应的标签序列，即可获知微珠上所载探针种类。由于荧光基团颜色种类有限，对于高密度基因芯片而言，需要多轮次显色为每种微珠形成颜色编码，根据颜色编码解读微珠上标签序列，每种微珠均需要多种带有不同荧光基团的互补杂交探针来解码，成本较高，同时多轮次杂交显色涉及多次dna变性和复性过程，对微珠上寡核苷酸链具有损伤作用，不利于后续分析检测。另外，当编码的微珠种类非常多时，需要生成大量的标签序列，易出现重复序列导致dna杂交特异性变差，准确度下降。

3、在现有技术中，也有研究提出多段标签序列依次杂交的杂交方式，即一种探针有多段标签序列，第一次解码实验与第一段标签序列杂交，第二次解码实验与第二段标签序列杂交，以此类推，但是此种方式仍未脱离互补杂交的原理，仅可以减少dna变性和复性的次数，无法从根本上解决问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基因芯片的编解码方法，以解决现有基因芯片编解码方法中成本高、对寡核苷酸链损伤大的缺点。

2、本发明所提供的基因芯片编解码方法，包括：

3、a）提供一种基因芯片；所述基因芯片包括：

4、k种寡核苷酸链修饰的微珠；

5、每种所述寡核苷酸链修饰的微珠包括微珠和与所述微珠共价耦合的寡核苷酸链；

6、所述k种寡核苷酸链修饰的微珠包括k种寡核苷酸链；

7、每种寡核苷酸链从所述5′端至3′端由标签序列和探针序列构成；

8、所述标签序列从5′端至3′端由编码序列和引物结合序列构成；

9、所述k种寡核苷酸链中的探针序列彼此不同；

10、所述k种寡核苷酸链中的所述标签序列中的所述编码序列彼此不同，其中，k≥1；

11、所述标签序列满足以下条件：

12、含有的连续的相同的碱基的数量不超过3个，gc含量为30%-60%，发夹结构的长度不超过4个碱基，所述标签序列之间的自互补片段不超过6个碱基，并且所述标签序列与目标基因组之间的相似性低于0.05；

13、b）使所述基因芯片中的所述k种寡核苷酸链修饰的微珠与m种可逆荧光终止子、引物和聚合酶一起孵育，其中m为2至4之间的整数；

14、c）基于所述可逆荧光终止子，选择荧光通道进行荧光拍照，然后判断是否能确定所述k种寡核苷酸链中的所述编码序列；

15、d）如果不能，使还原剂与荧光拍照后的所述k种寡核苷酸链修饰的微珠一起孵育，然后重复步骤b）和c），直到能确定所述k种寡核苷酸链中的所述编码序列。

16、在一个实施方案中，所述引物结合序列的长度为16~23 mer。

17、在一个实施方案中，所述编码序列的长度1-n，其中，mn≥k。

18、在一个实施方案中，所述还原剂为三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、谷胱甘肽、β-巯基乙醇种的任一种。

19、在一个实施方案中，所述寡核苷酸链为末端氨基修饰的寡核苷酸链；所述微珠为羧基修饰的聚苯乙烯微珠或二氧化硅微珠。

20、本发明还提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括k种寡核苷酸链修饰的微珠；每种所述寡核苷酸链修饰的微珠包括微珠和与所述微珠共价耦合的寡核苷酸链；所述k种寡核苷酸链修饰的微珠包括k种寡核苷酸链；每种寡核苷酸链从所述5′端至3′端由标签序列和探针序列构成；所述标签序列从5′端至3′端由编码序列和引物结合序列构成；所述k种寡核苷酸链中的探针序列彼此不同；所述k种寡核苷酸链中的所述标签序列中的所述编码序列彼此不同；其中，k≥1；所述标签序列满足以下条件：含有的连续的相同的碱基的数量不超过3个，gc含量为30%-60%，发夹结构的长度不超过4个碱基，所述标签序列之间的自互补片段不超过6个碱基，并且所述标签序列与目标基因组之间的相似性低于0.05。

21、本发明的基因芯片的编解码方法解码利用可逆荧光终止子读取，相比于传统的荧光探针解码，特异性更强，成本更低；解码不涉及寡核苷酸链的变性操作，对寡核苷酸链损伤更小，解码效率更高，更有利于后续分析检测实验。

技术特征：

1.一种基因芯片的编解码方法，其特征在于，所述编解码方法包括：

2.根据权利要求1所述的编解码方法，其特征在于，所述引物结合序列的长度为16~23mer。

3.根据权利要求1所述的编解码方法，其特征在于，所述编码序列的长度1-n，其中，m n≥k。

4.根据权利要求1所述的编解码方法，其特征在于，所述还原剂为三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、谷胱甘肽、β-巯基乙醇中的任一种。

5.根据权利要求1所述的编解码方法，其特征在于，所述寡核苷酸链为末端氨基修饰的寡核苷酸链；所述微珠为羧基修饰的聚苯乙烯微珠或二氧化硅微珠。

6.一种基因芯片，包括k种寡核苷酸链修饰的微珠；

7.根据权利要求6所述的基因芯片，其特征在于，所述引物结合序列的长度为16~23mer。

8.根据权利要求6所述的基因芯片，其特征在于，所述编码序列的长度1-n，其中，m n≥k。

9.根据权利要求6所述的基因芯片，其特征在于，所述寡核苷酸链为末端氨基修饰的寡核苷酸链。

10.根据权利要求9所述的基因芯片，其特征在于，所述微珠为羧基修饰的聚苯乙烯微珠或二氧化硅微珠。

技术总结
本发明公开了一种基于微珠测序的基因芯片编解码方法及基因芯片，所述方法包括：a）提供一种基因芯片；所述基因芯片包括：微珠和与所述微珠共价耦合的寡核苷酸链；每种寡核苷酸链从5′端至3′端由标签序列和探针序列构成；所述标签序列从5′端至3′端由编码序列和引物结合序列构成；使所述基因芯片中的寡核苷酸链修饰的微珠与可逆荧光终止子、引物和聚合酶一起孵育；基于所述可逆荧光终止子，选择荧光通道进行荧光拍照。本发明的编解码方法，特异性强，成本低，对寡核苷酸链损伤更小，解码效率更高。

技术研发人员：张迪鸣,张云山
受保护的技术使用者：之江实验室
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14