一种13C标记的土壤微生物残体制备方法

本发明涉及土壤微生物残体制备，特别是涉及一种13c标记的土壤微生物残体制备方法。

背景技术：

1、土壤有机碳库是陆地生态系统最大的碳库，其储存的碳高于大气和陆地所有植被碳的总和，对于维持土壤肥力、减缓气候变化和人类福祉至关重要。土壤中存在海量微生物，参与并调控土壤中的碳周转稳定过程，死亡后形成的残体在土壤中持续迭代累积，贡献于土壤有机碳的积累。因此，认知土壤微生物残体的周转过程与功能对实现土壤有机质的精准调控至关重要。然而，目前尚无法将土壤微生物残体从土壤中分离出来，限制了对土壤微生物残体的理解，研究微生物残体的周转通常是采用预先培养的方法。但是，目前还没有系统的土壤微生物残体制备技术。为了更好地研究土壤微生物残体的周转过程与功能，以及在土壤有机碳固持中的作用，为陆地生态系统土壤管理和可持续发展提供支持，亟需提供一种13c标记的土壤微生物残体制备技术来解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种13c标记的土壤微生物残体制备方法，旨在解决土壤微生物残体制备技术的空缺，为研究土壤微生物残体循环过程和功能制备实验材料。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种13c标记的土壤微生物残体制备方法，包括以下步骤：

3、步骤一：称取mgso4·7h2o溶解到双蒸馏水中，配制成1m的mgso4溶液，高温高压灭菌若干分钟；

4、步骤二：称取cacl2·6h2o溶解到双蒸馏水中，配制成1m的cacl2溶液，高温高压灭菌若干分钟；

5、步骤三：称取na2hpo4·12h2o、kh2po4、nacl和nh4cl溶解到双蒸馏水中，配制成5ⅹm9盐溶液，高温高压灭菌若干分钟；

6、步骤四：称取13c标记的葡萄糖溶解到双蒸馏水中，配制成20％的13c标记葡萄糖溶液，高温高压灭菌若干分钟；

7、步骤五：在无菌条件下，将5ⅹm9盐溶液、1m的mgso4溶液、1m的cacl2溶液和20％的13c标记葡萄糖溶液混合，并加入灭菌双蒸馏水，配制成m9培养基；

8、步骤六：称取nah2po4·h2o溶解到无菌水中，配制成a溶液；称取na2hpo4·12h2o溶解到无菌水中，配制成b溶液；取a溶液和b溶液混合均匀，配制成pb缓冲液；

9、步骤七：称取野外采集的新鲜土壤，放入已灭菌的三角瓶中，加入无菌水，振荡静置若干分钟，制备土壤微生物菌液；

10、步骤八：吸取所述土壤微生物菌液的上清液，加入到装有m9培养基的已灭菌三角瓶中，用带有透气性的封口膜封口后，将三角瓶放在摇床中，振荡培养若干天；

11、步骤九：待三角瓶内溶液浑浊后取出，转移到离心管中离心若干分钟，倒掉上清液后用pb缓冲液清洗若干次，然后将离心管放入冻干机中，冻干离心管中的沉淀物；

12、步骤十：将冻干的沉淀物取出，在干燥环境中密封保存供后期实验使用。

13、在本发明一个较佳实施例中，该方法包括以下步骤：

14、步骤一：称取mgso4·7h2o溶解到双蒸馏水中，配制成1m的mgso4溶液，121℃下高压灭菌15分钟；

15、步骤二：称取cacl2·6h2o溶解到双蒸馏水中，配制成1m的cacl2溶液，121℃下高压灭菌15分钟；

16、步骤三：称取na2hpo4·12h2o、kh2po4、nacl和nh4cl溶解到双蒸馏水中，配制成5ⅹm9盐溶液，121℃下高压灭菌15分钟；

17、步骤四：称取13c标记的葡萄糖溶解到双蒸馏水中，配制成20％的13c标记葡萄糖溶液，121℃下高压灭菌15分钟；

18、步骤五：在无菌条件下，将5ⅹm9盐溶液、1m的mgso4溶液、1m的cacl2溶液和20％的13c标记葡萄糖溶液混合，并加入灭菌双蒸馏水，配制成m9培养基；

19、步骤六：称取nah2po4·h2o溶解到无菌水中，配制成a溶液；称取na2hpo4·12h2o溶解到无菌水中，配制成b溶液；取a溶液和b溶液混合均匀，配制成ph值为6.8-7.0的pb缓冲液；

20、步骤七：称取8-10克野外采集的新鲜土壤，放入已灭菌的三角瓶中，加入无菌水，振荡15-20分钟，静置5-10分钟，制备土壤微生物菌液；

21、步骤八：吸取所述土壤微生物菌液的上清液，加入到装有m9培养基的已灭菌三角瓶中，用带有透气性的封口膜封口后，将三角瓶放在摇床中，在振荡频率为120-160次/分钟和27-30℃条件下培养25-30天；

22、步骤九：待三角瓶内溶液浑浊后取出，转移到离心管中在4500-5000转下离心10-12分钟，倒掉上清液后用pb缓冲液清洗2-3次，然后将离心管放入冻干机中，在-40℃下冻干离心管中的沉淀物；

23、步骤十：将冻干的沉淀物取出，在干燥环境中密封保存供后期实验使用。

24、本发明的有益效果是：本发明所使用的化学试剂容易获得、配制简单，获得微生物残体的效率比较高，13c标记的效果比较好，微生物残体的成分与原土壤微生物群落组成更相似。本发明方法步骤中，土壤微生物菌液培养温度是获得微生物残体的组成与原土壤微生物基本一致的关键条件，也是影响微生物残体被13c标记程度的因素；pb缓冲液的ph是影响获得微生物残体质量的重要条件。

技术特征：

1.一种13c标记的土壤微生物残体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的13c标记的土壤微生物残体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种<supgt;13</supgt;C标记的土壤微生物残体制备方法，包括以下步骤：分别配制MgSO<subgt;4</subgt;溶、CaCl<subgt;2</subgt;溶液、5ⅹM9盐溶液、葡萄糖溶液，在无菌条件下，将5ⅹM9盐溶液、1M的MgSO<subgt;4</subgt;溶液、1M的CaCl<subgt;2</subgt;溶液和20％的<supgt;13</supgt;C标记葡萄糖溶液混合，并加入灭菌双蒸馏水，配制成M9培养基；再配制PB缓冲液，制备土壤微生物菌液，土壤微生物培养，离心、清洗、冻干制备残体，冻干密封保存供后期实验使用。通过上述方式，本发明能够填补土壤微生物残体制备技术的空缺，为研究土壤微生物残体循环过程和功能制备实验材料。

技术研发人员：王清奎
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15