一种低温/高渗透压诱导响应基因启动子D14Q2及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程，具体涉及一种低温/高渗透压诱导响应基因启动子d14q2及其应用。

背景技术：

1、启动子是rna聚合酶识别、结合和开始转录的一段dna序列，它含有rna聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。但有一些启动子(如trna启动子)位于转录起始点的下游，这些dna序列可以被转录。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于转录起始位点的上游。

2、启动子就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的dna核苷酸，那么启动子也应由dna组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与被称为转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着rna聚合酶的活动。这种酶制造基因的rna复制本。一般分为广谱表达型启动子、组织特异性启动子、肿瘤特异性启动子等多种形式。基因的启动子部分发生突变，则导致基因表达的调节障碍。这种变化常见于恶性肿瘤。

3、为验证启动子是否在该条件下正确应答，可采用dna荧光定量比对的方式，即在该启动子下游插入一段带有特定已知序列的基因，在本启动子对应产生应答的uvb暴露环境进行一定时间的组织培养后用内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析等方式验证该序列相对于未插入启动子片段的细胞的转录量，经对比后即可初步判断该启动子对于相同基因在同一环境下表达量的影响。相同的，对于不便进行细胞层面dna荧光验证的条件，也可以在进行基因编辑时直接在启动子下游插入经转录翻译后可合成对该种作物有抗冻或抗高盐度效果的蛋白质的基因片段，并对该基因编辑作物在该种启动子对应诱导应答的环境下进行种植，以该基因编辑作物的存活率相对于为进行基因编辑插入启动子片段的对照组的存活率的对比，对该启动子在低温或高渗透压环境下对基因表达的调控效果进行验证。

技术实现思路

1、针对现有技术不足，本发明提供一种低温/高渗透压诱导响应基因启动子d14q2及其应用，提供了一种具有低温或高渗透压诱导应答特性的基因启动子，在农业生产的分子生物学层面育种中可以利用这样的方式培育出特殊品种的耐盐碱地、抗旱、抗冻品种。

2、为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

3、一种低温/高渗透压诱导响应基因启动子d14q2，其特征在于，所述基因启动子d14q2的dna核苷酸序列选自下列序列中任意一组：

4、(1)如seqidno.01所示的dna核苷酸序列，具体序列如下：

5、actaaatatatatagaacattattctatgaaggaaaagtatatgcaaccaaaaagttatcagccaaaaactaaataaaatcatattaatttatattaataattaattttaaattttttaaattcaaaatttagaaaatttaagtaaacctaattaaaacataaaaataccttcctcttctctttcacattaacctacccacttctaacaatcacacacagacctctctctcaccatcagaccctctccgcctcctcaccgcgacccactcctcttcttgaagtagaaagcgacacgttggagaggctttgcaccgacagggaatcggaggcgttgattgagtcggtccaatat

6、gacgtgagcgacgtggaggtggttggtgtcgaagcaatcggta

7、gcacgaatgagctcctctatgaaatcgaagccggtggcggaag

8、aattattggaggtgtcgtggaggaggcggtcgagggtagcagt

9、ggcattggcgtagttgtaggatatggtttggatgtctgggaatt

10、cgaagtgtgggtcgaaggaaggagagaagtcagggacattag

11、ggagggtggtcttgaacaaggatgggttggagttttcgtggaa

12、tccaaggtccttcatgatggagtcccaatcaagattgtgcagca

13、catggtcctctagctggtgaagaccctcttgctgtgtgttgggt

14、gcagtagccaccagcgcagccttctcaggggtggggcttctac

15、acaggtccagcaccaaaaaaacattcatttaatataaaaaaaa

16、catcttaatacttaacaaaagaaacatctaattatattttagcaa

17、aaataattaaatatctataaaatttaaaaaaaatatgaaattctt

18、aaagaaatggatattcacatttgcaatacaaaaaaattcgaaaa

19、atatataaaagaacatccatttagtatgaaaaagaaacattctga

20、tacttagtagaagaaacatccatatatattaactcgtagagattt

21、tgaattcattcaaagatatttggctggttttggctgatatgcttt

22、tggttccctagctttactcttctatgaaagataaaaacaaataa

23、agataagataagaacaactaaagataagataaagaaaaaataa

24、gataagataataaagactaaaattgtaattgaatttatgtattct

25、gttaggttaaatttgtgagccacgagacttctttattgatgtcat

26、ggactaaagtgaaagagtagtttaatataatttaaattaatcaaa

27、tgattaactcacttgtttatttaagtaagtatcatgatttaaattt

28、ttttaatgtataaactatagaaaaaaaattagtgtactgaaaata

29、ccgatattctagttgttttaaccgttaattttaattaatatatatta

30、tatatcttttttataatttagatcaacagttaaaataactggaac

31、actagtatttccagtatacataaaactcttcctaaactataaagc

32、aatttcttagccaattgcaagatcttaaatagctgcgacagatta

33、tttattggtaaccagattgagagatattacggagaatcaaaatat

34、tttttttttgttattattttggttggttttaatttggaggccagga

35、ggtccaaaataaaaagactaaccagaagcgtgaggaggcccat

36、cccatttttgtttatccaatatctattatcaaggcccaattagaag

37、tgacaaaaaagcccaatttaaagccttaattggaattaaatttg

38、gtcaagaacgcgtaagaagcattttattccaacctaaacaaca

39、gaaaccatatatctaatataattatctatctgtttatgaatcgtgat

40、agataagttaaccttggtctacacaaataaaaccataacacctc

41、attgagatgacaaaaagaatagtcttcgtgaaaagaaaattga

42、tcttgaaaatttgacaaaataacaaaaaaaagttgacaccgcc

43、atgggaatgatgaaacgtataattaataggacgattccacacac

44、aaaacggtcaatagcagccattggacttactcaaaatcatagca

45、ttcatgcaacaaaattgcaccacgtaccatacatgcatagttga

46、agattcaagcctcaattcctatatatacactaatgcacattaattg

47、ttaccatgtacttcactagctagctaccatagcaacattattttagaaagaaacaaaaatcattcactaatttcaccaaca；

48、(2)如seqidno.02所示的与seqidno.01的dna核苷酸序列反向互补的序列，即为与原序列形成完整碱基互补配对形成双链结构，而方向相反的单链序列，其中seqidno.02的序列如下：

49、tgttggtgaaattagtgaatgatttttgtttctttctaaaataatgttgctatggtagctagctagtgaagtacatggtaacaattaatgtgcattagtgtatatataggaattgaggcttgaatcttcaactatgcatgtatggtacgtggtgcaattttgttgcatgaatgctatgattttgagtaagtccaatggctgctattgaccgttttgtgtgtggaatcgtcctattaattatacgtttcatcattcccatggcggtgtcaacttttttttgttattttgtcaaattttcaagatcaattttcttttcacgaagactattctttttgtcatctcaatgaggtgttatgg

50、ttttatttgtgtagaccaaggttaacttatctatcacgattcata

51、aacagatagataattatattagatatatggtttctgttgtttaggt

52、tggaataaaatgcttcttacgcgttcttgaccaaatttaattcca

53、attaaggctttaaattgggcttttttgtcacttctaattgggcct

54、tgataatagatattggataaacaaaaatgggatgggcctcctca

55、cgcttctggttagtctttttattttggacctcctggcctccaaat

56、taaaaccaaccaaaataataacaaaaaaaaaatattttgattct

57、ccgtaatatctctcaatctggttaccaataaataatctgtcgcag

58、ctatttaagatcttgcaattggctaagaaattgctttatagttta

59、ggaagagttttatgtatactggaaatactagtgttccagttattt

60、taactgttgatctaaattataaaaaagatatataatatatattaatt

61、aaaattaacggttaaaacaactagaatatcggtattttcagtac

62、actaattttttttctatagtttatacattaaaaaaatttaaatcat

63、gatacttacttaaataaacaagtgagttaatcatttgattaattt

64、aaattatattaaactactctttcactttagtccatgacatcaata

65、aagaagtctcgtggctcacaaatttaacctaacagaatacataa

66、attcaattacaattttagtctttattatcttatcttattttttcttta

67、tcttatctttagttgttcttatcttatctttatttgtttttatcttt

68、catagaagagtaaagctagggaaccaaaagcatatcagccaaa

69、accagccaaatatctttgaatgaattcaaaatctctacgagttaa

70、tatatatggatgtttcttctactaagtatcagaatgtttctttttc

71、atactaaatggatgttcttttatatatttttcgaatttttttgtatt

72、gcaaatgtgaatatccatttctttaagaatttcatattttttttaa

73、attttatagatatttaattatttttgctaaaatataattagatgttt

74、cttttgttaagtattaagatgttttttttatattaaatgaatgttt

75、ttttggtgctggacctgtgtagaagccccacccctgagaaggc

76、tgcgctggtggctactgcacccaacacacagcaagagggtctt

77、caccagctagaggaccatgtgctgcacaatcttgattgggactc

78、catcatgaaggaccttggattccacgaaaactccaacccatcct

79、tgttcaagaccaccctccctaatgtccctgacttctctccttcct

80、tcgacccacacttcgaattcccagacatccaaaccatatcctac

81、aactacgccaatgccactgctaccctcgaccgcctcctccacga

82、cacctccaataattcttccgccaccggcttcgatttcatagagg

83、agctcattcgtgctaccgattgcttcgacaccaaccacctccac

84、gtcgctcacgtcatattggaccgactcaatcaacgcctccgatt

85、ccctgtcggtgcaaagcctctccaacgtgtcgctttctacttca

86、agaagaggagtgggtcgcggtgaggaggcggagagggtctga

87、tggtgagagagaggtctgtgtgtgattgttagaagtgggtagg

88、ttaatgtgaaagagaagaggaaggtatttttatgttttaattag

89、gtttacttaaattttctaaattttgaatttaaaaaatttaaaatta

90、attattaatataaattaatatgattttatttagtttttggctgataa

91、ctttttggttgcatatacttttccttcatagaataatgttctatatatatttagt；

92、(3)能够与seqidno.01或seqidno.02序列进行杂交的核酸序列；

93、(4)与seqidno.01或seqidno.02所述序列有至少95％序列一致性的序列；

94、(5)与seqidno.01或seqidno.02任一所述序列互补的dna或者rna序列。

95、优选的，所述基因启动子d14q2能在特定的低温或高渗透压条件下活化rna聚合酶，使之与模板dna准确的结合并具有转录起始的特异性。

96、优选的，所述基因启动子d14q2通过pcr扩增技术获得。

97、优选的，所述pcr扩增技术制备基因启动子d14q2时，需要根据现有的原始dna链配置两种引物：

98、(1)序列如seqidno.03所示：

99、actaaatatatatagaacattattc；

100、(2)序列如seqidno.04所示：

101、tgttggtgaaattagtgaatgattt。

102、优选的，所述基因启动子d14q2应用于培育耐盐碱地、抗旱、抗冻的植物品种，或者应用于培育改善盐碱地环境等特殊用途的聚盐植物。

103、优选的，所述应用方式为利用特定载体将启动子d14q2+特定基因的组合整合进细胞的染色体dna链中，再利用高渗透压环境或低温环境的环境因素诱导启动子的特定应答触发该基因的特定性状表达，培育出植物新品种。

104、优选的，所述特定载体为pcambia2300质粒序列。

105、优选的，所述特定基因为能够产生能调节体内渗透压的物质的基因。

106、本发明提供一种低温/高渗透压诱导响应基因启动子d14q2及其应用，与现有技术相比优点在于：

107、本发明提供的基因启动子d14q2能在所需特定的低温或高渗透压条件下活化rna聚合酶，使之与模板dna准确的结合并具有转录起始的特异性；利用特定载体将启动子+特定基因的组合整合进细胞的染色体dna链中后，就能够利用高渗透压环境或低温环境的环境因素诱导启动子的特定应答触发该基因的特定性状表达，在农业生产的分子生物学层面育种中可以利用这样的方式培育出特殊品种的耐盐碱地、抗旱、抗冻品种，或是结合其他基因培育可用于改善盐碱地环境等特殊用途的聚盐植物。