一种侧柏DNA条形码及其在亲缘关系鉴定中的方法与应用

本发明属于分子生物，具体涉及一种侧柏dna条形码的引物组合及其检测方法与应用。

背景技术：

1、侧柏(platycladusorientalis(l.)franco)是柏科侧柏属常绿针叶乔木，分布于我国东北、华北、西北、华中、东南、西南等20余个省(区、市)，种质资源丰富。侧柏抗旱耐瘠薄、适应性强，是重要的生态抗逆树种。侧柏材质细密，可制作器具、家具等，侧柏种子和鳞叶可入药，侧柏挥发性次生代谢物是重要的香料成分，具有重要的经济和社会价值。

2、遗传多样性是指种群内个体之间及种群间遗传变异的总和。遗传多样性分析有助于有效评价、保护侧柏种质资源并建立合理的评价体系，进而为侧柏种质资源创新利用提供科学依据。随着科技进步与发展，植物遗传多样性的检测手段得到了提高和改进，继形态标记、细胞学标记、生化标记后，dna分子标记能够反映植物基因组dna序列的变异，可以直接检验dna水平上的差异，已经广泛用于植物遗传多样性研究。dna条形码技术是用生物体dna中的一段保守片段对物种进行快速定位、准确鉴定的技术，具有操作简便、准确性高等特点，在遗传多样性分析、系统发育、种质鉴定等方面应用广泛。

3、现有技术中目前在侧柏方面的分子标记开发还较少，并未记载有针对侧柏的dna条形码及叶绿体dna引物用于鉴定侧柏种质资源，无法满足当前侧柏遗传学研究和遗传改良研究中的科研需求。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种用于侧柏属植物遗传多样性分析、亲缘关系鉴定等遗传分析的dna条形码、叶绿体dna引物及其应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种用于侧柏遗传多样性分析、亲缘关系鉴定等遗传分析的引物对组合物，由引物对甲、引物对乙和引物对丙组成；

4、引物对甲为特异结合侧柏的叶绿体基因组trns-trngspacer+intron的一对引物，所述trns-trngspacer+intron是一条链的核苷酸序列是seq id no.1的双链dna片段；

5、引物对乙为特异结合侧柏的叶绿体基因组trnt-5′trnl的一对引物，所述trnt-5′trnl是一条链的核苷酸序列是seq id no.2的双链dna片段；

6、引物对丙为特异结合侧柏的叶绿体基因组rbcl的一对引物，所述rbcl是一条链的核苷酸序列是seq id no.3的双链dna片段。

7、具体而言，所述引物对甲是由seq id no.4和seq id no.5所示的两条单链dna组成的引物对；所述引物对乙是由seq id no.7和seq id no.8所示的两条单链dna组成的引物对；所述引物对丙是由seq id no.9和seq id no.10所示的两条单链dna组成的引物对。

8、使用前述引物对组合物进行pcr扩增时，所述pcr扩增程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性60s，60-50℃降落退火60s，72℃延伸90s，10个循环；95℃变性60s，60-50℃降落退火60s，72℃延伸90s，25个循环；最终72℃延伸10min。

9、所述pcr扩增反应体系为50μl，包括10×buffer5μl，2.5mmdntp4μl，正向引物0.75μl(20μm)，反向引物0.75μl(20μm)，模板dna2.5μl，extaq酶0.5μl，ddh2o36.5μl。

10、其中，扩增trns-trngspacer+intron序列的正反引物如seq id no.4和seq idno.5所示，测序时还需要如seq id no.6所示的加测引物。扩增trnt-5′trnl序列的正反引物如seq id no.7和seq id no.8所示，测序时无需加测引物。扩增rbcl序列的正反引物如seq id no.9和seq id no.10所示，特别的，测序时还需要如seq id no.11所示的加测引物。

11、本发明还提供了一种用于鉴别侧柏的产品，其包括前述引物对组合物。

12、上述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒与仪器组成的系统，如由上述用于鉴定侧柏多样性或亲缘关系的引物对组合物和下述至少一种试剂和/或仪器组成的系统：进行pcr扩增所需的其它试剂、进行凝胶电泳所需的试剂、pcr仪、电泳仪、凝胶成像系统和照相机。

13、上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将前述引物分别单独包装的步骤。

14、当进行pcr时，seq id no.4所示单链dna和seq id no.5所示单链dna的摩尔比、seq id no.7所示单链dna和seq id no.8所示单链dna的摩尔比、seq idno.9所示单链dna和seq id no.10所示单链dna的摩尔比均为1:1。

15、本发明还提供了前述的引物组对合物或产品的如下任一种应用：

16、m1)侧柏属植物亲缘关系鉴定和/或分类；

17、m2)侧柏属植物遗传多样性分析和/或遗传结构分析；

18、m3)侧柏属植物分子标记辅助育种；

19、m4)侧柏属植物种质资源保护与利用；

20、m5)制备侧柏属植物亲缘关系鉴定和/或分类的产品；

21、m6)制备侧柏属植物遗传多样性分析和/或遗传结构分析的产品；

22、m7)制备侧柏属植物分子标记辅助育种的产品；

23、m8)制备侧柏属植物种质资源保护与利用的产品。

24、本发明还提供了一种鉴别或辅助鉴别侧柏品种资源的方法，包括如下步骤：以前述引物对扩增检测待测侧柏样品，拼接后得到待测样品的叶绿体基因间区序列，根据遗传距离对待检测样品的叶绿体基因间区序列进行聚类分析，若任意两个待测样品的叶绿体基因间区序列遗传距离为0，则两个待测样品为同一品种或种质或候选为同一品种或种质，若任意两个待测侧柏样品的叶绿体基因间区序列遗传距离不为0，该两个待测侧柏样品不为同一品种或种质或候选为非同一品种或种质。

25、具体而言，所述引物对扩增检测待测侧柏样品，拼接后得到待测侧柏样品的叶绿体基因间区序列具体包括如下步骤：

26、1)用前述seq id no.4和seq id no.5组成的引物对、seq id no.7和seq id no.8组成的引物对、seq id no.9和seq id no.10组成的引物对分别对待测样品进行pcr扩增，得到各引物对的pcr扩增产物；

27、2)测序所述各引物对的pcr扩增产物，将待测侧柏样品的各引物对的pcr扩增产物的测序结果拼接后得到待测侧柏样品的叶绿体基因间区序列。

28、本发明还提供了一种进行侧柏属植物遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：

29、1)采用前述引物对组合物对各待测侧柏种质的基因组dna进行pcr扩增并测序，获得trns-trngspacer+intron、trnt-5′trnl和rbcl序列；

30、2)将各待测侧柏的rns-trngspacer+intron、trnt-5′trnl和rbcl序列使用launchdnaspver6软件分析遗传多样性参数，完成侧柏遗传多样性分析。

31、所述遗传多样性参数包括核苷酸多样性(pi)、单倍型多样性(hd)。

32、若单倍型多样性(hd)＞0.5，则说明遗传多样性较高。

33、所述单倍型多样性是指不同待检测侧柏的trns-trngspacer+intron(和/或trnt-5′trn l、和/或rbcl)的序列的单倍型多样性。

34、本发明还提供了一种侧柏属植物亲缘关系鉴定的方法，包括如下步骤：

35、1)采用前述引物对组合物对各待测侧柏的基因组dna进行pcr扩增并测序，获得叶绿体dna间区的完整序列；

36、2)将各待测侧柏的上述叶绿体dna间区的完整序列进行比对，根据各待测侧柏的遗传距离构建系统发育树，分析各待测侧柏所属居群间的亲缘关系；若两个居群在一个分支，则说明二者亲缘关系较近，属于一个进化分支。

37、本发明还提供了一种dna条形码，包括前述trns-trngspacer+intron、trnt-5′trnl和rbcl。

38、上述任一所述应用或方法中，所述侧柏不仅包括侧柏属的各种品种、无性系、家系、优株，还包括其变种、栽培变种，以及它们的无性繁育(如扦插繁殖、嫁接繁殖)后代。

39、本发明基于侧柏叶绿体基因组序列开发设计获得了三个dna条形码及其扩增叶绿体引物，并利用不同来源的侧柏种质资源验证了本发明开发的dna条形码及其扩增引物在遗传多样性分析、亲缘关系鉴定方面的有效性。通过实验证明：本发明开发的dna条形码及其叶绿体dna引物实现了侧柏种质资源的准确鉴别，从母系遗传的角度揭示了侧柏的遗传多样性水平，有效丰富了侧柏属种质亲缘关系分析和遗传多样性评估的技术方法。利用本发明开发的dna条形码及其叶绿体dna引物能够进行侧柏属植物亲缘关系鉴定、遗传多样性分析等工作。可有效评估侧柏遗传多样性、系统发育和种质鉴定