人乳头瘤病毒HPV型别的鉴别方法与流程

本发明涉及一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，属于生物检测。

背景技术：

1、人乳头瘤病毒是乳头瘤病毒科(papillomaviridae)的成员，是具有8000bp环状基因组的dna肿瘤病毒。人乳头瘤病毒(hpv)与某些肿瘤的发病率显示强烈的相关。hpv在99％宫颈癌病人中可检测到。以流行病学资料为基础，在感染的病人中，不同hpv基因型在形成宫颈癌中不会造成相同的风险水平。根据这些发现基因型可分为低风险、中等风险和高风险等级，除了这些，也存在未分类的基因型。因为风险在很大的范围内变化，并且hpv感染的发病率很高，所以确定基因型极为重要。

2、研究表明与基因型分析有关的是hpv基因组图谱中那些显示特定类型多态性的区域。hpv基因组图谱中存在多个类型特异性序列变异性区域，但编码主要衣壳蛋白的晚期区域基因l1似乎是最具多态性的1-4。此外，早期区域基因e6和e7存在序列多态性5-7。这些序列的差异赋予个体hpv类型不同程度的致癌转化潜力，它们也可用于开发特定类型的分子测试。l1基因片段最常用于基于pcr的基因分型分析1,3。引物选自位于多态性、类型特异性序列两侧的保守或共有序列。

3、目前主要有3类用于检测hpv的核酸杂交方法。第一类是直接探针结合法，如有hpv类型特异性探针的sourthern印迹和点印迹等法8,9。但其缺点是灵敏度低、技术耗时且需要大量纯化的hpv探针。

4、第二类是信号放大法，但该类技术是不属于公共领域的专有技术。如美国digene公司的杂交捕获法(hybrid capture)，hc2是其拥有的专有核酸杂交信号放大系统，是目前美国获得fda批准并在国际上临床最广泛使用的一种检测hpv dna的检测技术。该技术主要是将针对包含要检测的hpv基因型的单个dna序列的特定rna探针与单束hpv dna杂交，通过化学发光检测到rna/dna杂交物。hc2能检测到的hpv基因型可分为以下风险等级：5种低风险hpv6、11、42、43和44型；以及13种高/中风险hpv类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。hc2可以检测出混合高危型hpv，但是不能检测出单一高危hpv基因型，因此其在hpv基因型的细分上能力有限。另外，hc2检测存在着高比率的假阴性和假阳性。

5、第三类方法是基于pcr的靶序列片段扩增技术，应用pcr对特异性hpv靶序列片段进行扩增，用特异性的寡核苷酸探针鉴别hpv型别。此类检测法的优点是：取样简便，检测及结果报告人为因素影响极少，适合在宫颈癌高危人群中进行大规模的初筛。缺点是大多数pcr方法虽然通常仅用于研究用途测试，但通常涉及使用获得专利的hpv序列，由于法律或专有技术限制，限制了它们作为体外诊断测试的适用性。

6、该类目前主要检测方法有：特异性pcr(type-specific pcr)法：该法根据e6、e7基因的变异区设计型特异性的引物进行pcr分析(walboomers，1999)，其灵敏度大约在几十至数百个hpv拷贝每反应，随hpv型别不同而稍有差异。然而，因为每份样本都需要同时作多份pcr，则导致无法高通量的使用。

7、pcr技术一般包括以下步骤：变性多核苷酸，然后将至少一对引物寡核苷酸退火到变性的多核苷酸上(使引物与变性的多核苷酸模板杂交)。退火步骤之后，具有聚合酶活性的酶，使用最初的变性多核苷酸作为合成模板，催化合成一条新的掺入了引物寡核苷酸的多核苷酸链。这一系列步骤(变性、引物退火和引物延伸)构成一个pcr循环。随着循环的重复，新合成的多核苷酸的量呈指数倍数增加。

8、dna的变性一般发生在约90-95℃，引物一般在约40-60℃退火至变性的dna，用聚合酶延伸退火的引物的步骤一般在约70-75℃进行。因此，在pcr循环中，必须改变反应混合物(反应体系)的温度，在多循环pcr实验中要多次改变。

9、pcr技术具有广泛的生物学应用，例如：dna序列分析、探针产生、克隆核酸序列、定位诱变、检测基因突变、诊断病毒感染等。然而，在实际应用中，无论的常规pcr反应还是多重pcr反应体系，如果环境或操作过程中引入极少量外源性dna污染，就可能出现假阳性结果。为了防止污染，一些实验不得不在高度洁净的操作设备或操作室进行。

10、在pcr反应过程中，各种试验条件控制不当很容易导致扩增失败，降低其灵敏度和特异性。

11、此外，现有pcr技术能够检测的灵敏度还难以令人满意，尤其是在对含量极低的核酸样品(如仅含1-10个拷贝目标序列的样品)。在活检、尸检样品中检测病原体(如hpv)时，因无关核酸物质的存在，检测灵敏度一直难以提高。

12、综上所述，目前还缺乏在封闭反应体系中，对pcr扩增产物简便有效地进行定量或半定量转移的方法。

13、洪国藩院士研究团队曾于2012年申请发明专利：多级pcr检测hpv的方法和试剂盒，该发明技术方案的主要创新点为采用多级pcr反应管，包括二个或多个可封闭的pcr反应腔或隔室，并且在至少两个隔室之间设有封闭的或可封闭的连接通道，连接通道用于让携带pcr扩增产物的固体颗粒从上游隔室转移至下游隔室；对于相互连通的多个隔室而言，当各自的腔盖全部盖上后，构成一个封闭空间，可有效消除pcr交叉干扰。

14、此外，根据洪院士团队以往经验，大约有7％的人会同时感染多种hpv亚型，此时一代测序会出现套峰，无法准确分型。基于针对不同亚型的病毒设计特异性引物进行分型pcr，即一份样本需要用20多个pcr反应进行鉴别，同时需要分别电泳。该方法工作量较大，不适用于大规模的检测。亟待研发出改进的鉴别方法。

15、以上内容涉及的参考文献如下：

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技术实现思路

1、本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强。

2、本发明解决其技术问题的技术方案如下：

3、一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，包括以下步骤：

4、第一步、采用dna提取试剂盒从目标样本中提取核酸dna；

5、第二步、在封闭的反应管的lcnpcr第一次反应空间中，以hpv基因组dna为模板，通过hpv特异性的第一引物对进行第一级pcr反应扩增，从而获得一级扩增产物p1；将第一扩增产物p1从lcnpcr第一次反应空间转移至反应管的lcnpcr第二次反应空间中，作为第二级pcr反应的模板；在lcnpcr第二次反应空间中，通过hpv特异性的第二引物对进行第二级pcr反应扩增，从而获得二级扩增产物p2；

6、第二级pcr反应采用染料法，并监测融解曲线；如果融解曲线没有特异峰则说明该样本阴性；若融解曲线有特异峰则对二级扩增产物进行一代测序，将测得的hpv序列与hpv标准序列进行比对鉴别出hpv的型别；若融解曲线有杂峰或套峰，则转至第三步；

7、第三步、对二级扩增产物p2进行第三级pcr反应获得三级扩增产物p3，经二代测序确定样本所含hpv的各个亚型；

8、其中，第二级pcr反应所用第二引物对的各引物末端含有便于第三级pcr反应加入样本标签的特定片段。

9、本发明进一步完善的技术方案如下：

10、优选地，反应管内设有材质与反应管相同的薄膜，该薄膜将反应管的反应空间分成彼此独立的lcnpcr第一次反应空间和lcnpcr第二次反应空间；反应管的管壁外部设有与lcnpcr第一次反应空间对应的凹向管内的凹记号。

11、优选地，薄膜高度为反应管封闭后内部空间高度的五分之四；反应管内放置的磁珠采用44dc钢球,直径1mm；反应管外配套的磁力棒采用钕铁硼特强磁铁棒。

12、优选地，第二级pcr反应采用的第二引物对为：gp6+-f序列为seq id no.1，以及my11-r序列为seq id no.2。

13、优选地，第三级pcr反应采用的引物包括index p5和index p7。其中，index p5包括：afa1序列为seq id no.3；afa2序列为seq id no.4；afa3序列为seq id no.5；afa4序列为seq id no.6；afa5序列为seq id no.7；afa6序列为seq id no.8；afa7序列为seq idno.9；以及afa8序列为seq id no.10。

14、index p7包括：hcrp1序列为seq id no.11；hcrp2序列为seq id no.12；hcrp3序列为seq id no.13；hcrp4序列为seq id no.14；hcr p5序列为seq id no.15；hcrp6序列为seq id no.16；hcrp7序列为s eq id no.17；hcrp8序列为seq id no.18；hcrp9序列为seqid no.19；hcrp10序列为seq id no.20；hcrp11序列为seq id no.21；以及h crp12序列为seq id no.22。

15、优选地，第一级pcr反应采用的引物对为：my09序列为seq id no.23；my11序列为seq id no.24。

16、与现有hpv的检测技术相比，本发明通过薄膜将反应管分为两个反应空间，即两次扩增反应置于同一管中进行，通过磁珠和磁力棒配合操作进行产物的转移，减少开盖次数，减少外部污染的可能性；同时，采用染料法替代电泳法，直接对待测的扩增产物进行一代测序，去除琼脂糖凝胶电泳步骤，减少实验花费时间，提高实验效率；此外，在实验使用的引物上进行了改进，加入了一段特定片段，便于产物二代测序，通过将一代测序与二代测序相结合，提高实验灵敏度和特异性，减少假阳性和假阴性结果的出现，确保了实验结果的可靠性和准确性。