鲤科鱼类病原体多联检测引物组合、微流控芯片和试剂盒

本发明涉及一种引物组合、微流控芯片、试剂盒及多联检测方法，尤其涉及一种鲤科鱼类病原体多联检测引物组合、微流控芯片、试剂盒及多联检测方法，属于生物。

背景技术：

1、鲤科鱼类是我国重要的水产养殖品种，包括鲤，鲫等；根据2021年《中国渔业统计年鉴》，我国鲤，鲫养殖总产量超过500万吨，产业规模达数百亿元。随着养殖规模的扩大，集约化程度的提高，池塘水质环境恶化等诸多因素，鲤/鲫病毒性病害频发高发，对产业造成巨大经济损失的同时，也危及水产品质量安全。其中鲤疱疹病毒ii型(cyprinidherpesvirus 2,cyhv-2)、鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus,svcv)、鲤鱼浮肿病毒(carp edema virus,cev)、锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,khv)等感染引起的鲤科鱼类病害呈现高流行性，高致病性等特征，严重影响我国鲤科鱼类养殖产业的健康可持续发展。然而，针对以上病毒性疫病尚无行之有效的治疗方法或防控药物；减少该类病原的流行性传播仍然是最有效的防控措施，这主要依赖于精准、快速、高通量的诊断技术。

2、环介导等温扩增技术(lamp)广泛应用于病原检测诊断，其针对病原靶基因多区域设计4-6种特异引物，在dna聚合酶(链置换dna聚合酶，bst dna polymerase)的作用下，生成自我循环扩增的颈环结构，使得靶标基因在短时间内大量、高效扩增；该技术除了高灵敏度、高特异性、反应时间短等优点外，不需要像pcr那样进行凝胶电泳或复杂高端的仪器设备，可基本满足基层快速诊断的需求。然而，水产疫病检测过程中不得不兼顾成本低，高通量，操作简单的客观需求；这也制约了该技术在水产疫病检测方面的应用。目前微流控芯片技术研究高速发展；该技术运用了微电机技术、微流体系统、生物化学等多方面技术在微纳米级别的空间内精确操控微尺度流体；多应用于物质分离，多生化指标检测等。微流控芯片技术是可把样品制备、核酸富集、纯化和检测等多个操作步骤集成到一块“微型化”的芯片上，简化操作过程(自动化处理)，可实现“样品进，结果出”。等温扩增技术是一种在恒温体系内对靶标核酸进行高效扩增的分子技术，其能够在短时间内完成目的基因的高指数增长。将核酸等温扩增技术与微流控芯片技术整合集成，能够凸显两者的优势，其不仅可以实现靶标核酸的快速扩增(保留环介导等温扩增技术的优势)，还可以降低反应体系，减少实验试剂耗材使用，增加检测通量，提高自动化水平等；两者整合集成在降低病原检测成本的同时凸显快速且高通量的优势；在水产病原快速检测、疫病精准诊断领域具有广阔的应用前景。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种高通量、特异性好、灵敏度高的鲤科鱼类病原体多联检测引物组合；本发明的另一目的是提供一种鲤科鱼类病原体多联检测的微流控芯片；本发明的另一目的是提供一种鲤科鱼类病原体多联检测试剂盒；本发明的另一目的是提供一种鲤科鱼类病原体多联检测方法。

2、技术方案：本发明的鲤科鱼类病原体多联检测引物组合，所述引物组合包括锦鲤疱疹病毒引物组、鲤鱼浮肿病毒引物组、鲤春病毒血症病毒引物组、鲤疱疹病毒ⅱ型引物组，其中：

3、锦鲤疱疹病毒引物组包括seq：id no：1所示的上游外引物khv-1-f3、seq id no：2所示的下游外引物khv-1-b3、seq id no：3所示的上游内引物khv-1-fip、seq id no：4所示的下游内引物khv-1-bip、seq id no：5所示的上游环引物khv-1-flp、seq id no：6所示的下游环引物khv-1-blp；

4、鲤鱼浮肿病毒引物组包括seq：id no：7所示的上游外引物cev-1-f3、seq id no：8所示的下游外引物cev-1-b3、seq id no：9所示的上游内引物cev-1-fip、seq id no：10所示的下游内引物cev-1-bip、seq id no：11所示的上游环引物cev-1-flp、seq id no：12所示的下游环引物cev-1-blp；

5、鲤春病毒血症病毒引物组包括seq：id no：13所示的上游外引物svcv-1-f3、seqid no：14所示的下游外引物svcv-1-b3、seq id no：15所示的上游内引物svcv-1-fip、seqid no：16所示的下游内引物svcv-1-bip、seq id no：17所示的上游环引物svcv-1-flp、seqid no：18所示的下游环引物svcv-1-blp；

6、鲤疱疹病毒ⅱ型引物组包括seq：id no：19所示的上游外引物cyhv-2-1-f3、seqid no：20所示的下游外引物cyhv-2-1-b3、seq id no：21所示的上游内引物cyhv-2-1-fip、seq id no：22所示的下游内引物cyhv-2-1-bip、seq id no：23所示的上游环引物cyhv-2-1-flp、seq id no：24所示的下游环引物cyhv-2-1-blp。

7、另一方面，本发明提供一种鲤科鱼类病原体多联检测的微流控芯片，所述微流控芯片上包埋有上述的引物组的干粉。

8、作为上述方案的进一步改进，所述微流控芯片包括若干个电极单元，每一个电极单元内包埋一种病原体的引物组。

9、作为上述方案的进一步改进，所述电极单元包括主输液电极通道、储液电极以及检测电极。

10、包埋构建鲤科鱼类病原微流控检测芯片，所述微流控芯片包含所述锦鲤疱疹病毒(khv)、鲤鱼浮肿病毒(cev)、鲤春病毒血症病毒(svcv)、鲤疱疹病毒ⅱ型(cyhv-2)四种病原微生物的lamp引物组。所述微流控芯片，包埋有锦鲤疱疹病毒(khv)、鲤鱼浮肿病毒(cev)、鲤春病毒血症病毒(svcv)、鲤疱疹病毒ⅱ型(cyhv-2)四种病原微生物的引物干粉。优化微流控芯片包埋所述四组引物组的浓度比例：优选地，锦鲤疱疹病毒引物组干粉中，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1～2：4～8：2～4，更优选地，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：4：2；优选地，锦鲤疱疹病毒引物组干粉中，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1～2：4～8：2～4；更优选地，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：4：2；优选地，鲤春病毒血症病毒引物组干粉中，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1～2：4～8：2～4；更优选地，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：4：2；优选地，鲤疱疹病毒ⅱ型引物组干粉中，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1～2：4～8：2～4；更优选地，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：4：2。

11、另一方面，本发明提供一种鲤科鱼类病原体多联检测试剂盒，所述试剂盒包含上述的微流控芯片、等温扩增微流控芯片检测反应液和标准阳性模板。

12、作为上述方案的进一步改进，等温扩增微流控芯片检测反应液包括反应液、dna聚合酶混合溶液、syto-9、ddh2o。

13、作为上述方案的进一步改进，标准阳性模板为含有锦鲤疱疹病毒(khv)、鲤鱼浮肿病毒(cev)、鲤春病毒血症病毒(svcv)、鲤疱疹病毒ⅱ型(cyhv-2)四种病原微生物特异靶标基因混合质粒dna。

14、另一方面，本发明提供一种鲤科鱼类病原体多联检测方法，所述方法包括以下步骤：

15、s1.将鲤科鱼类组织样品研磨破碎，提取组织及病原核酸，抽提核酸样品；

16、s2.等温扩增微流控芯片检测反应液与核酸样品混合，然后加入预先包埋引物组干粉的微流控芯片内；

17、s3.微流控芯片进行环介导等温扩增检测反应；

18、s4.检测结果判断。

19、优选的，步骤s3中，环介导等温扩增检测反应条件为：63℃15秒、60℃45s，30个循环。

20、作为上述方案的进一步改进，步骤s4中，根据是否出现“s”型扩增曲线判断待测样本中是否包含的鲤科鱼类病原体，并根据“s”型扩增曲线对应的电极单元，判断具体为何种病原体。

21、本发明利用微流控系统和核酸等温扩增技术相融合建立鲤科鱼类病原检测方法，证明其具有高特异性，高灵敏度和可重复性；可利用该方法高通量检测鲤科鱼类四种致病病原，应用于鲤科鱼类病毒病早期筛查，精准诊断和疫情监测。

22、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

23、(1)高通量：只进行单次检测即可同时判定锦鲤疱疹病毒(khv)、鲤鱼浮肿病毒(cev)、鲤春病毒血症病毒(svcv)、鲤疱疹病毒ⅱ型(cyhv-2)四种病原微生物的阴/阳性结果。

24、(2)特异性好：本发明用于引物设计的靶标基因是各病原的特异性片段，针对目的片段设计六条特异引物进行扩增，特异性强；四组引物不存在交叉检出，且对其他鱼类常见病原，不存在错误扩增。

25、(3)灵敏度高：对于含有这四种病原微生物检测靶标基因的混合阳性质粒，最低检出限可达到102copies/μl；

26、(4)操作简单且结果直接客观：操作步骤简单，可直接从复杂样品中检测锦鲤疱疹病毒(khv)、鲤鱼浮肿病毒(cev)、鲤春病毒血症病毒(svcv)、鲤疱疹病毒ⅱ型(cyhv-2)，通过观察扩增曲线直接判断阴阳性，结果直接客观，不需要繁琐的电泳等其他任何分析步骤，对操作人员的经验要求不高，适合水产养殖现场病原快速、准确检测。