一种快速增殖山莨菪细胞生物量的培养方法和培养基与流程

本发明属于植物细胞发酵领域，具体的涉及一种快速增殖山莨菪细胞生物量的培养方法。

背景技术：

1、山莨菪为我国青藏高原特有的药用植物,属茄科山莨菪属多年生草本植物,以肉质粗大的主根入药。山莨菪植物的生境复杂且多恶劣，导致资源自然更新率慢、资源稀缺，同时，随着现代研究的深入与其应用范围的逐渐扩大，目前国内莨菪类生物碱药物市场规模约80亿元，未来的国内市场潜力将超过120亿元以上，经济效益显著。与其广泛的应用形成鲜明的对比，山莨菪药材资源十分有限。山莨菪为青藏高原特有珍稀植物,生于海拔2200～4200m的山谷；山莨菪作为传统的藏药,常应用于镇痛解痉，活血去瘀，止血生肌等领域，临床价值显著、市场潜力广阔。

2、生物工程的悬浮培养技术是当今植物细胞实现工业化生产的必经之路；与固体培养相比，采用悬浮培养的方式，可使培养细胞和培养基之间具有更好的混合性和流动性，以及具有更高的传质效率，因而十分有利于培养细胞的快速生长；另外，采用悬浮培养方法还可为后续开展前体饲喂技术，实现有目的的向液体培养基中添加各种前体物质，经有效转化培养获得更多的植物活性成分。

3、目前没有山莨菪细胞悬浮培养的相关报道，只有山莨菪愈伤组织诱导的报道。如徐文华，等，藏药山莨菪组织培养技术研究，生物技术通报，2008年增刊，以田间栽培两年生山莨菪幼芽(休眠芽)、带叶柄幼叶为外植体，通过器官培养分化芽的途径达到快速繁殖。泽仁旺姆，藏药材-山莨菪的组织培养，西藏科技，2010年1期，是以藏药材山莨菪的种子为外植体进行诱导、分化培养,试验选用ms培养基,其中以附加naa0.2mg/l+6-ba 1mg/l的培养基中不定芽的分化较好,以附加naa0.2mg/l+6-ba 2mg/l培养基诱导愈伤组织和不定芽较好,在ms+iaa 0.5mg/l生根培养基上15天后生根率为100％。已有文献都是得到愈伤组织后，进行愈伤组织分化成芽加生根的研究，已报道的方法愈伤组织诱导率低、生长褐化率高，愈伤组织生长速度慢，若要实现工业化大规模生产，急需培养一种能够快速增殖且含有更多植物活性成分的山莨菪植物细胞。

技术实现思路

1、本发明为了解决上述背景技术中急需培养一种能够快速增殖且含有更多植物活性成分的山莨菪植物细胞的技术问题，提供一种愈伤组织诱导率高、愈伤组织生长褐化率低，快速增殖山莨菪细胞生物量的培养方法。

2、本发明提供了一种快速增殖山莨菪细胞生物量的培养方法，包括以下步骤：

3、s1、山莨菪愈伤组织的获得：采用消毒后的山莨菪种子接入ms培养基萌发，得到无菌幼苗，取所述无菌幼苗的胚轴接种至山莨菪愈伤组织诱导培养基，经过诱导培养得到所述山莨菪愈伤组织；

4、s2、愈伤组织的增殖培养：选取步骤s1中得到所述山莨菪愈伤组织中浅黄色部分接种至山莨菪愈伤组织增殖培养基，经过培养后得到增殖后的愈伤组织；

5、s3、初代山莨菪细胞悬浮培养：选取步骤s2中得到的所述增殖后的愈伤组织中浅黄色部分接种至初代山莨菪细胞液体培养基，培养后得到初代山莨菪细胞；

6、s4、继代培养山莨菪细胞增殖培养：取培养了24～28天后的步骤s3所述的初代山莨菪细胞接种至继代山莨菪细胞增殖培养液体培养基，培养后得到山莨菪细胞。

7、其中，步骤s1所述的山莨菪愈伤组织诱导培养基是以改良ms培养基为基础培养基，在所述改良ms培养基中每升含以下成份：

8、萘乙酸0.4～0.8mg、6-苄氨基腺嘌呤0.5～1.5mg、2,4-二氯苯氧乙酸1～2mg、玉米素0.1～0.3mg、l-半胱氨酸20～40mg、蔗糖20～40g；且ms培养基中不含硝酸铵，硝酸钾的浓度为2850mg/l；

9、步骤s2中所述的山莨菪愈伤组织增殖培养基是以ms培养基为基础培养基，在所述ms培养基中每升含以下成份：

10、萘乙酸0.6～1.0mg、6-苄氨基腺嘌呤0.1～0.3mg、2,4-二氯苯氧乙酸1～3mg、精氨酸2～4mg、鸟氨酸2～4mg、蔗糖25～45g；

11、步骤s3中所述的初代山莨菪细胞液体培养基是以改良ms培养基为基础培养基，在所述改良ms培养基中每升含以下成份：

12、6-苄氨基腺嘌呤0.1～0.2mg、2,4-二氯苯氧乙酸1.5～2.5mg、激动素0.1～0.3mg、酵母多糖40～80mg、谷氨酰胺60～100mg、蔗糖15～35g；

13、所述改良ms培养基中叶酸浓度为1mg/l、维生素b6的浓度为10mg/l、维生素b1的浓度为1mg/l；

14、步骤s4中所述的继代山莨菪细胞增殖液体培养基是以改良ms培养基为基础培养基，在所述改良ms培养基中每升含以下成份：

15、6-苄氨基腺嘌呤0.3～0.5mg、2,4-二氯苯氧乙酸1.0～3mg、激动素0.1～0.3mg、酵母多糖100～200mg、苯丙氨酸60～80mg、蔗糖20～40g；

16、所述改良ms培养基是指ms培养基中的ki浓度为0.75mg/l，h3bo3的浓度为3mg/l、mnso4·h2o的浓度为10mg/l。

17、进一步优选地，步骤s1中所述ms培养基中每升含以下成份：萘乙酸0.6mg、6-苄氨基腺嘌呤1mg、2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg、玉米素0.2mg、l-半胱氨酸30mg、蔗糖30g；

18、步骤s2中所述ms培养基中每升含以下成份：萘乙酸0.8mg、6-苄氨基腺嘌呤0.2mg、2,4-二氯苯氧乙酸2mg、精氨酸3mg、鸟氨酸3mg、蔗糖35g；

19、步骤s3中所述的初代山莨菪细胞液体培养基是以改良ms培养基为基础培养基，在所述改良ms培养基中每升含以下成份：6-苄氨基腺嘌呤0.15mg、2,4-二氯苯氧乙酸2mg、激动素0.2mg、酵母多糖60mg、谷氨酰胺80mg、蔗糖25g；步骤s4中所述的继代山莨菪细胞增殖培养液体培养基每升含以下成份：6-苄氨基腺嘌呤0.4mg、2,4-二氯苯氧乙酸2mg、激动素0.2mg、酵母多糖150mg、苯丙氨酸70mg、蔗糖35g。

20、其中，步骤s1中所述诱导培养的条件为：在20～28℃下避光培养。

21、其中，步骤s2中所述增殖培养的条件为：在25～29℃下避光培养。

22、其中，步骤s3中接种量为20～40g/l，所述培养的条件为选择回旋震荡摇床、转速90～130r/min，在温度22～28℃下避光培养。

23、其中，步骤s4中，接种量为35～55g/l，所述培养的条件为选择回旋震荡摇床、转速100～140r/min，在温度24～28℃下每天光照8～12小时，光照强度为800～1200lx。

24、本发明还提供了一种山莨菪细胞，它是由所述的快速增殖山莨菪细胞生物量的培养方法制备得到。

25、本发明得到愈伤组织后，进行愈伤组织的悬浮培养，悬浮培养的山莨菪细胞生长速度更快生物量增加更快，且目前尚未有中文文献进行过山莨菪细胞悬浮培养的相关报道。

26、本发明通过优化培养基的成分和组成，提高了愈伤组织的诱导率和增殖倍数，从而实现了快速的增殖。同时，本发明采用悬浮培养的方式，使得山莨菪细胞在液体培养基中生长，避免了固体培养基上存在的营养物质不均一的问题，从而实现了更快的生长和更高的生物量，有助于提高山莨菪细胞的培养效率和产量。

27、本发明的有益效果是，针对性地提出了一种采用生物技术的细胞悬浮培养方法，在人为控制条件下实现山莨菪植物细胞的快速生产，以缓解当前山莨菪药材资源严重紧缺的问题，确保山莨菪植物资源可持续的利用。本发明以生物工程的细胞悬浮培养技术，采用山莨菪植物的胚轴为外植体诱导产生的愈伤组织细胞进行悬浮培养，并建立了山莨菪细胞的悬浮培养体系，很好地解决了当前山莨菪植物资源短缺的问题。该方法可实现大规模快速生产山莨菪植物有效成分含量高的培养物，以满足当前市场对山莨菪药材的大量需求。