一种标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体及其构建和应用方法

本发明涉及医药生物领域，具体是指一种标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体及其构建和应用方法。

背景技术：

1、骨架蛋白是细胞中起结构支撑作用的一类蛋白质，其在细胞力学调控、下游信号转导改变、基因表达调控等方面具有重要作用。心脏中，骨架蛋白直接介导了心脏的收缩舒张功能。骨架蛋白的变异是造成心脏疾病的主要原因之一，在心脏疾病的诊断和治疗中具有重要价值。由于心脏骨架蛋白本身溶解度低，传统的分子互作研究技术，如免疫共沉淀coip等，难以精确系统地研究动物体内与心脏骨架蛋白联系的临近分子。为了解决这个问题，之前有研究开发了bioid技术(k.j.roux,d.i.kim,m.raida,b.burke,a promiscuousbiotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins inmammalian cells.journal of cell biology 196,801-810,2012)，在细胞中将骨架蛋白与突变的生物素转移酶bira*融合，从而在骨架蛋白附近，用生物素标记其他分子。进一步利用生物素-链霉亲和素的特异的强相互作用，科学家能够富集和鉴定骨架蛋白附近的生物素标记的分子，从而发现临近骨架蛋白的其他分子。

2、早期的bioid技术由于缺乏成熟有效的体内递送载体，仅用于体外培养的细胞研究(p.li,j.li,l.wang,l.j.di,proximity labeling of interacting proteins:application of bioid as a discovery tool.proteomics 17,2017)。例如，有研究在体外培养的人多能干细胞来源的心肌细胞的肌原纤维骨架蛋白actn2附近标记临近分子(feriaa.ladha,etal.,actininbioidrevealssarcomerecrosstalkwithoxidative metabolismthroughinteractionswithigf2bp2,cellreports,volume36,issue6,2021)。其主要缺点有：①体外培养的心肌细胞不能正常成熟，这导致体外培养的心肌细胞细胞骨架结构紊乱，因此本技术不能准确标记体内骨架蛋白临近分子；②本技术仅仅展示了actn2的临近标记能力，该技术是否能够应用到其他类型的骨架蛋白，特别是细胞核与闰盘等其他亚细胞空间的骨架蛋白，并不清楚。

3、为了在动物体内运用此技术，有科学家开发了腺相关病毒载体(adeno-associatedvirusvector,aav)，向体内心脏中递送bioid系统，实现了动物体内的临近蛋白组学分析，例如在动物体内的心肌细胞的细胞膜-内质网膜二联体(dyad)附近标记蛋白的技术(lu,f.,ma,q.,xie,w.etal.cmya5establishescardiacdyadarchitectureandpositioning.natcommun13,2185,2022)。其主要缺点有：①细胞膜-内质网膜二联体(dyad)临近分子多为可溶性生物膜相关分子，该技术是否能够应用到可溶性低的骨架蛋白，特别是肌原纤维、细胞核与闰盘等其他亚细胞空间的骨架蛋白，并不清楚；②该技术利用bira*为临近标记酶，酶活性较低，能否用更高效的bioid2或turboid酶进行临近标记，如何进行技术配套优化，并不清楚。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种心肌细胞特异性地标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体及其构建和应用方法。具体公开了标记心脏肌原纤维z线、核纤层、闰盘这三种心脏细胞骨架的腺相关病毒载体序列及应用。相比于传统的细胞内邻近标记系统，本体系可以对体内难溶性骨架蛋白做心脏特异性临近标记。实施例证明其在标记亚细胞结构相关骨架蛋白的临近分子的通用性，具有较大的应用前景。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、一方面，本发明提供一种心肌细胞特异性标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒(aav)载体，包含：aav蛋白衣壳和aav核酸分子；其中，所述aav蛋白衣壳为选自aav2i8、aav1、aav6、aav8、aav9和/或myoaav中的一种或多种；所述aav核酸分子包含心肌细胞特异性启动子、骨架蛋白基因和具有临近标记功能的生物素连接酶基因。

4、所述aav核酸分子由4部分构成：①itr(inverted terminal repeat)，反向末端重复序列：能形成高度稳定的二级结构，在病毒的复制和包装过程中起着必要作用。②心肌细胞特异性启动子：驱动aav转基因在心肌细胞中特异性表达。③goi(gene of interest)基因，即心脏骨架蛋白基因：包括但不限于actn2、lmna、lmnb1、ctnna3或jup基因。标记肌原纤维z线的actn2(actinin alpha2)基因，编码辅肌动蛋白α2，是心肌细胞肌小节z线结构的重要组成部分，在心肌纤维排列方面起着重要的作用，同时还协调着肌小节细胞骨架与细胞膜的相互连接。标记核纤层的lmna、lmnb1基因，分别编码核纤层蛋白a、核纤层蛋白b1，是核纤层的骨架蛋白。标记闰盘的ctnna3、jup基因，分别编码连环蛋白3和连接斑珠蛋白，是闰盘介导细胞连接的核心结构蛋白。④生物素连接酶基因：包括但不限于bioid2、turboid的编码基因，其编码蛋白融合连接在骨架蛋白的n端或c端，催化骨架蛋白临近的10nm范围内的内源分子生物素化。

5、在本发明的一些实施例中，心脏骨架蛋白包括心脏肌原纤维z线、核纤层或闰盘的主要结构蛋白。肌原纤维(myofibril)：横纹肌细胞的收缩舒张马达，由粗肌丝和细肌丝组装而成。粗肌丝的主要成分是肌球蛋白，细肌丝的主要成分是肌动蛋白，辅以原肌球蛋白和肌钙蛋白。肌原纤维由肌小节(sarcomere)头尾重复连接而成，连接处形成特殊的横纹结构，称作z线。z线将细肌丝、肌联蛋白等纤维交联在一起，核心交联蛋白为辅肌动蛋白(α-actinin)。心肌细胞中的主要辅肌动蛋白亚型为actn2(actinin alpha2，α-actinin-2)。

6、核纤层(nuclear lamina)：核纤层普遍存在于高等真核细胞中，是内层核被膜下纤维蛋白片层，纤维纵横排列整齐呈纤维网络状。核纤层在核内与核基质连接，在核外与中间纤维相连，构成贯穿于细胞核和细胞质的统一网架结构体系。形成核纤层的核心结构蛋白称为核纤层蛋白(lamin)，属于五型中间纤维蛋白家族。成熟心肌细胞中主要表达的核纤层蛋白亚型为lamin-a/c和lamin-b1，分别由lmna和lmnb1基因编码。

7、闰盘(intercalated disk)：闰盘由相邻两个心肌细胞的细胞膜分支处伸出的短突相互嵌合而成，能使电兴奋和机械力从一个细胞传播到另一个细胞，利于心肌纤维同步收缩。在闰盘部位，心肌细胞膜特化，凹凸相连，形状呈阶梯状。在该处相邻两细胞膜在横向上的连接方式有桥粒和中间连接(黏合带)，保证心肌纤维间的紧密连接；纵向上有缝隙连接，便于细胞间的化学交流和电冲动的传导。闰盘形成的结构基础为心肌细胞特有的跨过细胞膜的黏附蛋白，以及黏附蛋白在细胞内侧的细胞骨架支撑蛋白。代表性的细胞骨架蛋白包括但不限于连环蛋白3(ctnna3)和连接斑珠蛋白(jup)。

8、在本发明的一些实施例中，所述aav载体的dna中包含心肌细胞特异性启动子以及启动子的3’端连接的编码基因，编码骨架蛋白与生物素连接酶的融合蛋白。

9、在本发明的一些实施例中，所述的标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体，所述心脏特异性启动子的核苷酸序列包括但不限于人源tnnt2启动子序列或鸡源tnnt2启动子序列；所述人源tnnt2序列如seq id no.1所示，所述鸡源tnnt2序列如seq id no.2所示。

10、在本发明的一些实施例中，所述的标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体，所述心脏骨架蛋白基因，包括但不限于标记肌原纤维z线的actn2基因、标记核纤层的lmna、lmnb1基因和标记闰盘的ctnna3、jup基因。

11、在本发明的一些实施例中，所述的标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒(aav)载体，所述心脏骨架蛋白基因的编码核酸序列包括actn2、lmna、lmnb1、ctnna3或jup；所述编码核酸序列actn2如seq id no.3所示，或者是与actn2核酸序列编码的氨基酸序列具有超过90％同源性的其他编码序列；所述编码核酸序列lmna如seq id no.4所示，或者是与lmna核酸序列编码的氨基酸序列具有超过90％同源性的其他编码序列；所述编码核酸序列lmnb1如seq id no.5所示，或者是与lmnb1核酸序列编码的氨基酸序列具有超过90％同源性的其他编码序列；所述编码核酸序列ctnna3如seq id no.6所示，或者是与ctnna3核酸序列编码的氨基酸序列具有超过90％同源性的其他编码序列；所述编码核酸序列jup如seqid no.7所示，或者是与ctnna3核酸序列编码的氨基酸序列具有超过90％同源性的其他编码序列。

12、在本发明的一些实施例中，所述的标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体，所述生物素连接酶的编码核酸序列包括bioid2或turboid，所述编码核酸序列bioid2如seq id no.8所示，或者是与bioid2核酸序列编码的氨基酸具有超过90％同源性的其他编码序列；所述编码核酸序列turboid如seq id no.9所示，或者与turboid核酸序列编码的氨基酸具有超过90％同源性的其他编码序列。

13、在本发明的一些实施例中，所述的标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体，所述生物素连接酶的编码序列位于lmna或lmnb1序列的5’端，或者位于actn2、ctnna3或jup序列的3’端。

14、在本发明的一些实施例中，所述的标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体，所述生物素连接酶的编码序列和所述骨架蛋白的编码序列之间，通过柔性蛋白linker的编码序列进行连接，所述柔性蛋白linker的编码序列如seq id no.10所示；或者所述柔性蛋白linker的编码序列为其他编码多肽长度超过10个氨基酸，且含有甘氨酸和丝氨酸的编码序列。

15、另一方面，本发明提供一种标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体的构建方法，包括如下步骤：

16、(1)制备用于aav载体生产的含有aav核酸分子的质粒dna：

17、所述aav质粒dna包含本发明所述的核酸序列，所述序列位于itr序列之间；

18、(2)三质粒法在hek293细胞中包装aav载体：

19、所述三质粒法指将含有aav核酸分子的质粒dna以及另外两个aav包装所需的质粒(即prepcap和phelper质粒)共同转染hek293细胞后，在无血清培养基培养的细胞中生成aav颗粒；

20、(3)纯化aav载体：

21、所述纯化aav载体的方法包括利用peg从无血清培养基中沉淀aav、反复冻融从hek293细胞中释放aav、利用密度梯度离心法初步纯化aav、以及利用超滤离心方法进一步纯化和浓缩aav等步骤。

22、再一方面，本发明提供所述的标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体在心肌细胞中特异性进行骨架蛋白临近标记的应用，所述应用方法包括如下步骤：

23、(1)将aav载体注射到动物体内；

24、(2)对aav处理后的动物注射生物素；

25、(3)提取、裂解步骤(1)和(2)处理的动物的心脏，提取蛋白、核酸等可以临近标记的分子；

26、(4)利用链霉亲和素磁珠从步骤(3)的裂解物中富集、纯化临近标记的蛋白、核酸等物质；

27、(5)利用质谱方法分析临近标记的蛋白，和/或利用测序方法分析临近标记的核酸。

28、本发明还提供一种心肌细胞特异性标记心脏骨架蛋白临近分子的试剂，所述试剂包含本技术所述的一种标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体。

29、本发明还提供一种心肌细胞特异性标记心脏骨架蛋白临近分子的试剂盒，所述试剂盒包含本技术所述的一种标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体、包含该载体的试剂、和/或应用aav载体在心肌细胞中特异性进行骨架蛋白临近标记的生物素、链霉亲和素磁珠、缓冲液等其他试剂。

30、本发明的有益效果在于：

31、(1)利用本发明提供的腺相关病毒(aav)载体，可以在体内心肌细胞中进行骨架蛋白临近标记。actn2、lmna、lmnb1、ctnna3和jup等骨架蛋白的体内临近标记实施例，证实了本发明标记肌原纤维z线、核纤层、闰盘等多种不同亚细胞结构相关骨架蛋白的临近分子的有效性和通用性；

32、(2)应用高效的bioid2酶进行体内临近标记，对actn2、lmna、lmnb1、ctnna3和jup等结构蛋白进行体内临近标记，并检测临近分子，发现其体内心肌细胞中的临近蛋白质组，利用已知临近蛋白进行结果比对，证实了本发明提供的腺相关病毒(aav)载体标记肌原纤维z线、核纤层、闰盘等多种不同亚细胞结构相关骨架蛋白的临近分子的高效性；

33、(3)本发明提供的标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体，相比于传统的细胞内邻近标记系统，可以对体内难溶性骨架蛋白做心脏特异性临近标记，解决体外细胞培养邻近标记实验不够准确的问题。