一种用于MK-n生产的乳酸乳球菌及其构建方法与应用

本发明属于微生物发酵，具体涉及一种用于mk-n生产的乳酸乳球菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、维生素k2是种脂溶性维生素，对人体健康起重要作用，包括凝血和骨骼健康。其同系物是由甲基萘醌主环(mk)上的异戊二烯单元个数(n)所组成，通常用mk-n表示。有研究表明，长链的维生素k2(n>6)相较于短链(n<5)在人体内具有更长的半衰期和更高的吸收量。

2、目前，对于维生素k2的微生物来源主要集中在纳豆芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。在日本，人们通过食用纳豆芽孢杆菌发酵的纳豆产品来获取维生素k2来达到每日0.75-1μg/kg体重的摄取量。但由于纳豆独特的风味，导致国内人群受众极少，所以将目光集中于世界包括国内更易于接受且具备生产维生素k2潜力的乳酸菌上。作为乳制品，包括酸奶、奶酪发酵的微生物，乳酸菌被证实具备合成长链维生素k2的潜力。但是，由于长期的环境胁迫和个体进化，导致乳酸菌逐渐转为专型发酵的菌株，其呼吸链上用于电子传递的甲基萘醌合成相关的men系列基因以及用于合成血红素来刺激细胞色素氧化酶活性的相关基因丢失，致使乳制品中的用于乳酸菌有氧呼吸的甲基萘醌，即维生素k2含量很低。所以提高乳酸菌在发酵产品里维生素k2的产量是亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于mk-n生产的乳酸乳球菌及其构建方法与应用。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种用于mk-n生产的乳酸乳球菌，所述乳酸乳球菌为乳酸乳球菌(lactococcus lactis subsp cremoris)mg1363-p1，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2023年6月12日，菌种保藏编号为cctcc no:m2023987。

3、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种用于mk-n生产的乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于：包括：构建外源导入bs168菌株的men系列基因以提高mg1363甲基萘醌主环的合成能力，外源导入嗜热地衣芽孢杆菌的合成异戊二烯侧链基因以提高mg1363异戊二烯侧链合成能力；再通过添加不同剂量的外源血红素和不同碳氮源的配比来优化发酵培养的条件，提高长链mk-n的合成。

4、3、根据权利要求2所述的用于mk-n生产的乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

5、步骤1：选取pmg36e质粒上的多克隆位点区域的kpnⅰ和hindⅲ酶切位点进行双酶切获得线性化质粒，然后利用sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒纯化回收，获得pmg36e-kh载体；

6、步骤2：pcr扩增来自枯草芽孢杆菌bs168基因组上的menf、mena基因与嗜热地衣芽孢杆菌的ispa基因；

7、步骤3：步骤1获得的pmg36e-kh载体与步骤2获得的双链dna片段进行无缝克隆连接，获得连接产物；

8、步骤4：将步骤3的连接产物加入到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰浴25-40min，40-44℃水浴40-70s后于冰上放置1.5-2.5min，加入不含抗生素的lb培养基，于35-40℃摇床200-240rpm震荡50-60min；将菌液均匀涂到红霉素抗性的平板上，35-40℃培养箱培养12-16h；挑取单克隆菌落进行菌落pcr，用通用引物进行测序，鉴定正确的重组质粒进行菌液抽提重组质粒pmg36e-afi并保存；

9、步骤5：将步骤4提取得到的正确的质粒利用电转化的方法转入mg1363感受态细胞中，接种至含有5μg/ml的红霉素抗性平板上，28-32℃培养70-75h，挑取单克隆菌落进行菌落pcr，用通用引物进行测序，鉴定正确保存菌株；

10、步骤6：将获得的菌株接种于发酵培养基：①、含0.5％葡萄糖的m17；②、含不同剂量的外源血红素和不同碳氮源的配比的m17/牛奶发酵培养基中，220rpm有氧发酵96h后用高效液相色谱法测定mk-n的产量。

11、优选的技术方案为：步骤1中，所用到的质粒pmg36e为大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭组成型表达载体，保存于大肠杆菌dh5α中；具备乳酸乳球菌复制子pwv01，滚环型复制，大小3.6kb；启动子p32；红霉素抗性标记；多克隆位点；双酶切体系及酶切条件：pmg36e质粒1μg，莫纳的kpnⅰ、hindⅲ快切酶各1μl，10×缓冲液1μl，加ddh2o补足体系至20μl混匀；37℃反应15min以上3h以下，80℃失活20min。

12、优选的技术方案为：步骤2中，pcr扩增目的基因，上下游引物序列如下：

13、mena-f：aacctgcaggcatgcaagcttatgaaccaaacaaataagggtgaggg

14、mena-r：ttgtcaccatttatcggaaatagctgatcaataatccgatcg

15、menf-f：tttccgataaatggtgacaacggtgcagc

16、menf-r：gctgcgccactcaacgcctctcacctcctaatg

17、ispa-f：gaggcgttgagtggcgcagctttcagttga

18、ispa-r：ccaaatatcgtagcgccggggtaccttaatggtcgcgggcgg

19、反应体系：

20、

21、

22、反应程序：所有成分加样后混匀后反应，反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性10s；55℃退火10s；72℃延伸1kb/10s；变性-退火-延伸循环次数为35次；然后72℃充分延伸10min；4℃保存。

23、优选的技术方案为：步骤1、2中的产物均用sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒纯化产物后，将所有产物用莫纳无缝克隆试剂盒进行连接；步骤3中的连接体系：hi-fusioncloning mix v2 5μl，线性化载体50～200ng，插入片段10～200ng，ddh2o to 10μl，50℃反应15-30min，获得产物。

24、优选的技术方案为：步骤5中的mg1363感受态的制备：①、菌株活化后在gm17平板上划线培养，挑取单菌落在10ml gsgm17液体中培养，30℃，静置12h左右；②、取5ml菌液于50ml gsgm17液体中扩大培养，30℃，静置12h左右；③、取15ml菌液于100ml gsgm17液体中培养，30℃，静置3～4h，此时od600为0.5左右；④、将培养好的菌液置于冰水混合物中冷却，冷却时摇动，使菌液充分冷却；⑤、将菌液分装于预冷的离心管中，4℃条件下离心15min，转速5,200rpm，弃上清，加入预冷的洗液ⅰ，1/2体积，重悬菌体，置于冰水混合物上静置15min；⑥、4℃条件下离心15min，转速5,200rpm，弃上清，加预冷的洗液ⅱ，1/2体积，重悬菌体，置于冰水混合物上静置15min；⑦、4℃条件下离心15min，转速5,200rpm，弃上清，加入预冷的洗液ⅰ，1/2体积，重悬菌体，置于冰水混合物上静置15min；⑧、4℃条件下离心15min，转速5,200rpm，弃上清，用100～200μl的洗液ⅰ重悬菌体，分装预冷的无菌离心管中，-80℃保存。

25、优选的技术方案为：电转条件：①、1.0mm电转杯；②、电转仪数值：电阻为200ω、脉冲为25μf、电压为1600v；③、电转步骤：将1ng的构建质粒加入100μl乳酸乳球菌mg1363感受态细胞中混匀后全部加入预冷的1.0mm电转杯中，放入电转仪中，1600v电击后加入1000μl预冷的gm17-mc复苏培养基，吹吸后转移于无菌离心管中，30℃复苏2h，然后涂布于含5μg/ml红霉素抗性平板上。

26、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种用于mk-n生产的乳酸乳球菌的应用，所述乳酸乳球菌在发酵制备mk-n的应用，所述乳酸乳球菌为乳酸乳球菌(lactococcus lactis subsp cremoris)mg1363-p1，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2023年6月12日，菌种保藏编号为cctcc no:m2023987。

27、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

28、本发明构建的乳酸乳球菌，生长快速、代谢相对简单，不同于大肠杆菌，不会产生任何内毒素和形成包涵体；不同于枯草芽孢杆菌，不会产生孢子；不产生任何胞外蛋白酶；单层细胞膜，利于分泌外源蛋白；基因组小，胞内外蛋白相对较少，易于纯化。故相较于其他菌种更适合且安全有效的生产mk-n。