一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法与流程

【】本发明属于基因工程领域，特别涉及一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法

背景技术

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背景技术：

1、ddr1(盘状结构域受体1)是一种受体酪氨酸激酶(rtk)，与多种细胞功能相关，如细胞增殖、分化、粘附、迁移和侵袭(kimhget al,2011)。ddr1是促进乳腺导管形成的结构上皮的关键介质，并且已被证明参与细胞迁移，通过降低细胞之间肌动蛋白的活性来促进细胞迁移(hidalgocarcedo c et al,2011)。ddr1作为iigfs的调节剂参与细胞稳态、细胞代谢、细胞存活和发育等行为。同时，ddr1功能复杂，ddr1基因缺失抑制了青春早期乳腺的发育，但又能增加后期乳腺管的分枝。ddr1基因敲除小鼠表现为胚胎植入和乳腺发育缺陷且出现不规则细胞生长和乳腺细胞外基质异位，在妊娠晚期发现导管细胞分化异常且不能分泌乳汁。

2、牛奶中蛋白质主要有乳清和酪蛋白两大类，酪蛋白又分为β-酪蛋白、k-酪蛋白和α-酪蛋白，a2-β酪蛋白是现代奶牛β-酪蛋白的天然原型，a2-β酪蛋白更接近人体母乳的蛋白质。研究表明，水牛奶含有丰富的β酪蛋白(14.2g/kg)，远大于牛奶(9.0g/kg)和母乳(2.4g/kg)中β酪蛋白的含量。因此，提高水牛奶中酪蛋白含量具有重要意义。

3、目前尚未发现ddr1基因调控水牛乳腺发育及泌乳的相关研究，对于ddr1基因调控水牛乳腺发育和泌乳的机理尚不清楚，而乳脂和乳蛋白含量是衡量水牛乳品质的重要标准，本发明的研究是探讨ddr1基因在转录和转录后水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌功能的分子机制，以期为水牛重要经济性状的研究提供理论依据。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的是提供一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法，该方法简单、高效、精确，能为后续挖掘与鉴定影响奶牛乳成分性状的关键基因或致因突变提供研究方向。

2、为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

3、一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法，该方法包括如下步骤：

4、(1)利用干扰片段转染水牛乳腺上皮细胞，在37℃条件下，含5％co2的培养箱中培养48h；

5、(2)ddr1基因细胞的过表达：将ddr1基因真核表达载体利用脂质体转染法转染到乳腺上皮细胞中，48h后收集乳腺上皮细胞，检测细胞表型和相关基因的表达水平；

6、(3)乳脂含量检测：包括油红o染色和甘油三酯测定；

7、1)油红o染色：水牛乳腺上皮细胞经过ddr1干扰和过表达处理后用甲醛-钙固定，蒸馏水洗涤后用异丙醇洗涤，油红o染液染色后异丙醇分化至间质清晰，蒸馏水洗涤后，用苏木素复染后，蒸馏水洗涤后用甘油明胶封片，显微镜下观察各组乳脂分泌浓度；

8、2)甘油三脂含量检测：水牛乳腺上皮细胞经ddr1干扰和过表达处理后用pbs洗涤，用胰酶消化、离心收集细胞后进行裂解，混匀后室温静置；取适量上清液转移到离心管中，加热处理后，离心，取上清液进行酶学甘油三酯含量检测；

9、(4)乳蛋白含量检测：水牛乳腺上皮细胞经ddr1干扰和过表达处理后用细胞刮刀刮下细胞，细胞和上清混悬液经反复冻融，使细胞释放细胞内成分，离心，收集上清检测酪蛋白浓度。

10、进一步说明，在步骤(1)中，转染时的细胞密度为70％-90％。

11、进一步说明，在步骤(1)中，所述干扰片段序列如下所示：

12、siddr1：5’-acctacgatggatatacca-3’。

13、进一步说明，在步骤(2)中，所述ddr1基因的核苷酸序列如序列表中seq id no：1所示。

14、ddr1过表达载体核苷酸序列如序列表中seq id no：2所示。

15、进一步说明，在步骤(3)中，所述油红o染色的具体操作如下：水牛乳腺上皮细胞经过ddr1干扰和过表达处理后用甲醛-钙固定15min，蒸馏水充分洗涤后用质量浓度60％异丙醇洗涤30s，油红o染液染色15-20min后，质量浓度60％异丙醇分化至间质清晰，蒸馏水洗涤后，用苏木素复染3-5min后，蒸馏水洗涤后用甘油明胶封片，显微镜下观察各组乳脂分泌浓度。

16、进一步说明，在步骤(3)中，所述甘油三脂检测的具体操作如下：水牛乳腺上皮细胞经ddr1干扰和过表达处理后用pbs洗涤2次，用胰酶消化、离心收集细胞后进行裂解，混匀后室温静置10分钟；取适量上清液转移到离心管中，70℃加热10分钟，室温2000rpm离心5分钟，取上层清液用于酶学甘油三酯检测。

17、进一步说明，在步骤(4)中，所述离心的时间为20分钟。

18、进一步说明，在步骤(4)中，所述酪蛋白浓度包括α-酪蛋白浓度、β-酪蛋白浓度和k-酪蛋白浓度。

19、与现有技术相比较，本发明具有以下有益效果：

20、本申请从分子水平上对水牛乳腺上皮细胞乳脂、乳蛋白含量进行调控，通过构建过表达载体和干扰片段sirna-ddr1分别转染水牛乳腺上皮细胞，最终达到了在分子水平调控上皮细胞乳脂、乳蛋白含量的目的，通过研究发现，ddr1的过表达能够在分子水平提高水牛乳腺上皮细胞甘油三酯含量、提高水牛乳腺上皮细胞α-酪蛋白含量和β-酪蛋白含量，降低水牛乳腺上皮细胞k-酪蛋白含量，该方法简单、高效、精确，能为后续挖掘与鉴定影响奶牛乳成分性状的关键基因或致因突变提供研究方向，是从分子水平上实施水牛高乳脂量、高乳蛋白量新品系分子培育的前提与基础。

技术特征：

1.一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法，其特征在于，在步骤(1)中，转染时的细胞密度为70-90％。

3.根据权利要求1所述一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述干扰片段序列如下所示：

4.根据权利要求1所述一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述ddr1基因的核苷酸序列如序列表中seq idno：1所示。

5.根据权利要求1所述一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述油红o染色的具体操作如下：水牛乳腺上皮细胞经过ddr1干扰和过表达处理后用甲醛-钙固定15min，蒸馏水充分洗涤后用质量浓度60％异丙醇洗涤30s，油红o染液染色15-20min后，质量浓度60％异丙醇分化至间质清晰，蒸馏水洗涤后，用苏木素复染3-5min后，蒸馏水洗涤后用甘油明胶封片，显微镜下观察各组乳脂分泌浓度。

6.根据权利要求1所述一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述甘油三脂检测的具体操作如下：水牛乳腺上皮细胞经ddr1干扰和过表达处理后用pbs洗涤2次，用胰酶消化、离心收集细胞后进行裂解，混匀后室温静置10分钟；取适量上清液转移到离心管中，70℃加热10分钟，室温2000rpm离心5分钟，取上层清液用于酶学甘油三酯检测。

7.根据权利要求1所述一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述离心的时间为20分钟。

8.根据权利要求1所述一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述酪蛋白浓度包括α-酪蛋白浓度、β-酪蛋白浓度和k-酪蛋白浓度。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的方法，该方法通过构建DDR1基因的过表达载体和干扰载体来对水牛的DDR1基因进行调控，从分子学水平上调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白含量的含量，而目前，国内外还未见有从调节DDR1基因的调控从而达到在分子水平调控水牛乳腺上皮细胞分泌乳脂和/或乳蛋白的相关报道，该方法能为从分子水平上调控生产高乳脂量、高乳蛋白量水牛做出积极贡献。

技术研发人员：陆杏蓉,尚江华,邓廷贤,段安琴,杨春艳,郑海英,马小娅
受保护的技术使用者：广西壮族自治区水牛研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15