一种接头及其在构建单链环形DNA文库中的应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种接头及其在构建单链环形dna文库中的应用。

背景技术：

1、目前的二代测序(next generation sequencing，ngs)基础是测序文库的构建。文库构建流程通常包括：(1)将未片段化的基因组dna进行超声波打断，或者酶片段化处理(如使用血浆游离dna或其它已片段化的dna可省略此步)；(2)将dna片段进行末端缺口补齐修复；(3)在经过末端修复的dna片段的5’末端磷酸化，3’末端添加单碱基a(腺嘌呤)以便获得具有单个碱基粘性末端；(4)将具有粘性末端a的dna片段与根据不同测序平台设计的接头相连(接头可带样本标签)，以获得连接产物；(5)如果是对靶向富集区域测序(如全外显子组测序或ngs panel测序)，通过接头上的各测序平台的通用引物对连接产物进行pcr，以获取足量的扩增后的dna文库(在此步亦可引入样本标签)；(6)将扩增后的dna文库用探针捕获法或靶向引物法进行目标区富集制备测序文库。但是相关技术中采用ngs测序存在建库时间长，样本单次测序准确率低，文库长度短的问题仍亟需解决。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种接头，能够实现单一样本的多次测序，提高测序的准确度。

2、本发明还提出一种含有上述接头的试剂盒。

3、本发明还提出上述接头或试剂盒的应用。

4、本发明还提出一种单链环形dna文库的制备方法。

5、根据本发明的一个方面，提出了一种接头，所述接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头的序列如seq id no:1所示，所述第二接头的序列如seq id no:2所示。

6、在本发明的一些实施方式中，所述第一接头序列的3'端添加碱基t和硫代修饰。

7、在本发明的一些实施方式中，所述硫代修饰为硫代磷酸酯修饰。

8、在本发明的一些实施方式中，所述第二接头的序列的5'末端的核苷酸带有磷酸基团。

9、根据本发明的第二方面，提出了一种试剂盒，所述试剂盒含有上述接头。

10、根据本发明的第三方面，提出了上述接头或试剂盒的应用，所述应用为在制备单链环形dna文库中的应用。

11、在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备用于测序的产品中的应用。

12、根据本发明的第四方面，提出了一种单链环形dna文库的构建方法，所述制备方法包括以下步骤：

13、s1、对待测生物的基因组dna进行片段化处理，获取片段化dna；

14、s2、对片段化dna进行末端修复；

15、s3、将上述接头和s2得到的末端修复后的片段化dna进行连接，形成两端加接头的dna片段；

16、s4、将两端加接头的dna片段作为模板，用特异性引物对进行pcr扩增，从而获得dna扩增产物；

17、s5、将步骤s4得到的dna扩增产物进行环化处理，制备得到单链环形dna文库。

18、在本发明的一些实施方式中，所述片段化处理的方式采用dna打断管或超声打断。

19、在本发明的一些实施方式中，还包括对步骤s1得到的片段化dna进行纯化的步骤。

20、在本发明的一些实施方式中，所述纯化采用磁珠进行纯化。

21、在本发明的一些实施方式中，在将接头与片段化dna进行连接之前，还包括将第一接头和第二接头的序列进行退火的步骤。

22、在本发明的一些实施方式中，所述退火的程序为92-98℃孵育2-5min，降温至温度为18-22℃。

23、在本发明的一些实施方式中，所述退火采用的体系包括终浓度为20-30μm的第一接头序列、终浓度为20-30μm的第二接头序列、终浓度为45-55mm的nacl溶液，终浓度为8-12mm的tris和终浓度为0.05-0.2mm的edta。

24、在本发明的一些实施方式中，所述接头与末端修复后的片段化dna进行连接的反应程序如下：18-22℃，加热12-18min；60-68℃，8-12min终止反应。

25、在本发明的一些实施方式中，还包括将步骤s3制备得到的两端加接头的dna片段进行纯化的步骤。

26、在本发明的一些实施方式中，所述特异性引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列如seq id no:3所示，所述反向引物序列如seq id no:4所示。

27、在本发明的一些实施方式中，所述正向引物的5'末端的核苷酸带有磷酸基团。

28、在本发明的一些实施方式中，所述正向引物的3'端添加碱基t和硫代修饰。

29、在本发明的一些实施方式中，所述反向引物的3'端添加碱基t和硫代修饰。

30、在本发明的一些实施方式中，所述pcr扩增的程序为：

31、

32、在本发明的一些实施方式中，所述pcr扩增的反应体系包括：终浓度为1×的high-fidelity 2×master mix、终浓度为0.4～0.6μm的上下游引物、终浓度为0.4-0.8ng/μl的基因组dna。

33、在本发明的一些实施方式中，还包括对dna扩增产物进行纯化的步骤。

34、在本发明的一些实施方式中，所述环化处理包括将dna扩增产物、splint primer和缓冲溶液进行反应，得到带有splintprimer的中间产物；再将中间产物与环化缓冲液和连接酶反应得到单链环形dna文库。

35、在本发明的一些实施方式中，所述dna扩增产物、splint primer和缓冲溶液进行反应的体系包括：终浓度为2-3μm的splint primer、终浓度为0.04-0.06μg/μl的dna扩增产物。

36、在本发明的一些实施方式中，所述dna扩增产物、splint primer和缓冲溶液进行反应的程序为：92-96℃加热2-4min后，0-4℃放置2-5min。

37、在本发明的一些实施方式中，所述将中间产物与环化缓冲液体系和连接酶反应的反应程序为35-38℃加热55-65min；60-70℃，处理8-12min。

38、在本发明的一些实施方式中，所述splint primer序列如seq id no:5所示。

39、在本发明的一些实施方式中，所述环化处理还包括消化不成环的dna扩增产物的步骤。

40、在本发明的一些实施方式中，还包括采用滚环扩增(rca)验证的步骤。

41、根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案，通过接头的设计，进行单链环形dna文库的制备，将样本制备成环形dna，并通过滚换复制多次扩增，可以实现单一样本的多次测序，提高测序的准确度，且建库时间短，文库长度大于10kb。

技术特征：

1.一种接头，其特征在于，所述接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头的序列如seq id no:1所示，所述第二接头的序列如seq id no:2所示。

2.根据权利要求1所述的接头，其特征在于，所述第一接头的序列的3'端添加碱基t和硫代修饰；和/或，所述第二接头的序列的5'末端的核苷酸带有磷酸基团。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的接头。

4.权利要求1或2所述的接头和权利要求3所述试剂盒中的一种在制备单链环形dna文库中的应用。

5.权利要求1或2所述的接头和权利要求3所述试剂盒中的一种在制备用于测序的产品中的应用。

6.一种单链环形dna文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，在将接头与片段化dna进行连接之前，还包括将第一接头和第二接头的序列进行退火的步骤。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述退火的程序为92-98℃孵育2-5min，降温至温度为18-22℃。

9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述特异性引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列如seq id no:3所示，所述反向引物序列如seq id no:4所示；优选地，所述正向引物的5'末端的核苷酸带有磷酸基团；优选地，所述正向引物的3'端添加碱基t和硫代修饰；优选地，所述反向引物的3'端添加碱基t和硫代修饰。

10.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述环化处理包括将dna扩增产物、splint primer和缓冲溶液进行反应，得到带有splintprimer的中间产物；再将中间产物与环化缓冲液体系和连接酶反应得到单链环形dna文库；优选地，所述splint primer序列如seq id no:5所示。

技术总结
本发明公开了一种接头及其在构建单链环形DNA文库中的应用，所述接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头的序列如SEQ ID NO:1所示，所述第二接头的序列如SEQ ID NO:2所示，本发明方案通过接头的设计，进行单链环形DNA文库的制备，将样本制备成环形DNA，并通过滚换复制多次扩增，可以实现单一样本的多次测序，提高测序的准确度，且建库时间短，文库长度大于10kb。

技术研发人员：萨利姆·巴尔迪,田梓轩,何筠,田晖,伊戈尔·伊万诺夫,弗拉基米尔·巴什基洛夫,高亚平
受保护的技术使用者：安序源生物科技（深圳）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16