一种筛选抑制Stx2噬菌体激活的化合物的方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种筛选抑制stx2噬菌体激活的化合物的方法。

背景技术：

1、随着畜禽养殖业的快速、规模化发展，病原菌感染给养殖业发展造成的经济损失也日益上升。大肠杆菌是造成仔猪腹泻和死亡的重要病原菌之一，其致病能力与其毒力因子密切相关，如志贺毒素等。目前抗生素是常用于解决问题的手段之一，但是养猪生产中大量使用抗生素促进了细菌耐药性的增强以及毒力因子的传播，严重威胁仔猪肠道健康。

2、近年来，开发利用抗生素替代品成为行业研究的热点、焦点和难点。噬菌体是一种能够侵染细菌的微生物，对畜禽感染的致病菌具有杀灭作用，具有靶向性强、安全性高、无药残、杀菌更彻底和绿色环保的特点，可作为有效的抗生素替代品之一。但是噬菌体作为抗生素替代品的研究仍处于研究阶段，部分噬菌体本身可能会生产不利于动物养殖的毒素。

3、产志贺毒素大肠杆菌的致病性主要与其产生的2型志贺毒素(stx2)有关。编码stx2的基因位于大肠杆菌stx2原噬菌体基因组中。stx2原噬菌体的激活导致编码stx2基因的表达和stx2的形成与释放。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种筛选抑制微生物生产stx2能力的化合物的方法。基于reca基因的启动子构建双荧光素酶报告质粒，将其转导入微生物得到一种双荧光素酶报告系统，其可以准确筛选出对于stx2噬菌体激活有抑制效果的化合物。

2、第一方面，本发明提供一种筛选抑制stx2噬菌体激活的化合物的方法，包括：

3、将双荧光素酶报告质粒转入微生物中，在培养的过程中加入待测样品；

4、检测荧光信号，并根据结果判断所述待测样品抑制stx2噬菌体激活的能力；

5、所述双荧光素酶报告质粒包括reca基因的启动子。

6、进一步地，所述reca基因包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。

7、进一步地，所述reca基因的启动子包括如seq id no.2所示的核苷酸序列。

8、进一步地，所述双荧光素酶报告质粒通过如下方法制备得到：

9、将所述reca基因的启动子构建至pmcs-fluc-sv40-hrluc-neo质粒第5095bp的位置

10、进一步地，所述微生物为大肠杆菌。

11、进一步地，所述将双荧光素酶报告质粒转入微生物中包括：

12、通过离子转化法、电穿孔法、冷冻脉冲法、热激法或静电吸附法将所述双荧光素酶报告质粒包含的质粒转入所述微生物的感受态细胞中。

13、进一步地，所述荧光信号包括：萤火虫荧光素酶的荧光信号和海肾萤光素酶的荧光信号。

14、进一步地，所述根据结果判断所述待测样品抑制stx2噬菌体激活的能力包括：

15、将所述萤火虫荧光素酶的荧光信号和所述海肾萤光素酶的荧光信号的比值和对照比值进行比对；根据比对结果判断所述待测样品对于stx2噬菌体激活的抑制能力；

16、所述对照比值为根据不包括所述reca基因的启动子的同种双荧光素酶报告质粒转入同种微生物中，检测荧光信号，并根据结果确定得到。

17、第二方面，本发明提供rreca基因的启动子的核酸作为抑制stx2噬菌体激活能力的标志物的应用。

18、本发明进一步提供所述的方法在检测化合物抑制stx2噬菌体激活的能力中的应用。

19、本发明进一步提供l-阿拉伯糖在抑制stx2噬菌体激活中的应用。

20、进一步地，所述微生物为大肠杆菌。

21、本发明具备如下有益效果：

22、本发明将reca基因的启动子构建至双荧光素酶表达质粒中，并进一步转入微生物中得到一种可以验证化合物对于微生物生产stx2能力的抑制功能的双荧光素酶报告系统。该双荧光素酶报告系统的荧光活性与stx2噬菌体产量有着一致的变化趋势，因此可以经由荧光信号的变化指示stx2噬菌体产量，进而就能够判断出化合物抑制stx2噬菌体激活的能力。本发明提供的双荧光素酶报告系统可以应用筛选可特异性抑制stx2噬菌体激活的功能性营养素，并且具备较优的准确率。

技术特征：

1.一种筛选抑制stx2噬菌体激活的化合物的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述reca基因包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述reca基因的启动子包括如seq idno.2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双荧光素酶报告质粒通过如下方法制备得到：

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光信号包括：萤火虫荧光素酶的荧光信号和海肾萤光素酶的荧光信号。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述根据结果判断所述待测样品抑制stx2噬菌体激活的能力包括：

8.reca基因的启动子的核酸作为抑制stx2噬菌体激活能力的标志物的应用。

9.权利要求1-8任一项所述的方法在检测化合物抑制stx2噬菌体激活的能力中的应用。

10.l-阿拉伯糖在抑制stx2噬菌体激活中的应用。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种筛选抑制Stx2噬菌体激活的化合物的方法。包括：将双荧光素酶报告质粒转入微生物中，在培养的过程中加入待测样品；检测荧光信号，并根据结果判断所述待测样品抑制Stx2噬菌体激活的能力；所述双荧光素酶报告质粒包括recA基因的启动子。本发明将recA基因的启动子整合至双荧光素酶报告质粒中，导入微生物中得到一种双荧光素酶报告系统，该报告系统的荧光信号变化和Stx2噬菌体产量有着一致的变化趋势，可以准确指示化合物对于Stx2噬菌体激活的抑制能力。

技术研发人员：王军军,胡杰,武祎凡,韩丹丹,康露渊,刘一思
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15