抗体结合蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及蛋白质突变体相关。更具体地说，本发明涉及一种抗体结合蛋白及其应用。

背景技术：

1、抗体是脊椎动物浆细胞产生的非常重要的糖蛋白之一，被免疫系统用来识别和中和细菌和病毒等异物。1975年，科勒和米尔斯坦开发了杂交瘤技术，并产生了第一个单克隆抗体。从那时起，抗体成为分子水平研究的一个非常重要的工具。此外，由于抗体以高亲和力和特异性识别和结合其抗原，因此它们用于抗原的灵敏和选择性检测(免疫测定)。与液相色谱和质谱等需要大型且昂贵的仪器的传统分析方法不同，该免疫分析具有方便、简单和操作快速等显著优点。然而，进一步提高免疫分析性能的需求一直存在，例如在更短的时间内以更高的灵敏度检测靶标，以实现早期癌症诊断等困难但要求苛刻的任务。

2、而且，最近，抗体也以非常快的速度开发，成为治疗各种癌症和类风湿性关节炎等顽固性疾病的关键药物。如今，许多制药公司将注意力集中在抗体药物抗体的开发上。人源化抗体和人源抗体特别令人感兴趣，因为它们被认为对治疗应用有价值，避免了啮齿动物抗体经常观察到的人抗小鼠抗体反应。然而，作为一种药物，包括人抗体在内的生物制剂的纯度对生物制药行业来说是一个具有挑战性的问题。

3、对于抗体的纯化，通常使用亲和色谱法。作为亲和配体，应用最广泛的是抗体结合蛋白，即蛋白a和蛋白g。由于这些抗体结合蛋白通过非共价键结合igg的各个亚类，因此它们不太可能消除抗体的功能。蛋白a是金黄色葡萄球菌的主要细胞壁成分蛋白，蛋白g是一种在c组和g组链球菌中表达的免疫球蛋白结合蛋白，与蛋白a非常相似，但具有不同的特异性。它是一种65kda(g148蛋白g)和58kda(c40蛋白g)细胞表面蛋白，蛋白g由近600个氨基酸残基组成。羧基末端半部分包含三个免疫球蛋白g(igg)结合结构域，称为结构域c1、c2和c3，每个c结构域包含55个氨基酸残基，带有两个“间隔”，即16个氨基酸dl和d2。它通过独立和隔开的结合位点对人igg的fab和fc片段具有亲和力。对几乎所有哺乳动物免疫球蛋白g(igg)类别表现出极大的亲和力，包括所有人类igg亚类(igg1，igg2，igg3和igg4)以及兔，小鼠和山羊igg。蛋白g结合来自小鼠igg1，igg2a和igg3以及大鼠igg2a，igg2b和igg2c的所有测试单克隆igg。此外，来自人、牛、兔、山羊、大鼠和小鼠的多克隆igg与蛋白g结合，而鸡igg则不结合。蛋白g的nh2末端一半的结构域可以结合人血清白蛋白(hsa)，但在结构上与igg结合区域的位点分离。蛋白g与igg亚类的结合范围比葡萄球菌蛋白a更广泛。这适用于来自牛、大鼠、山羊、人和兔源的多克隆igg，以及几种大鼠和小鼠单克隆抗体。所以蛋白g是检测igg的强效试剂，因此也是这些抗体所针对的抗原。它用于蛋白质印迹分析，以检测硝酸纤维素膜上的各种抗原抗体复合物。此外，蛋白g在亲和色谱中被广泛用作与树脂偶联的配体，用于抗体纯化。然而，大多数基于蛋白质的亲和色谱介质对碱性条件表现很脆弱。这是许多工业应用中的一个主要问题，在这些应用中，能够从色谱介质中去除污染物至关重要，通常通过集成原位清洗(cip)方案来实现。在该方案中，浓度范围为0.1至1m的氢氧化钠是最常用的试剂。当将它们用作结合配体时，蛋白质对高ph值的极端恶劣环境的敏感性是一个缺点。

4、因此，有必要设计一种能够一定程度克服上述缺陷的技术方案。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供一种抗体结合蛋白及其应用，该抗体结合蛋具有较好的耐碱性和igg亲和力。

2、为了实现本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了抗体结合蛋白，所述抗体结合蛋白的氨基酸序列由seq id no:1所示的氨基酸序列发生突变得到，所述突变至少包括天冬酰胺残基突变为除了谷氨酰胺残基之外的其它氨基酸。

3、进一步地，所述突变还包括甘氨酸残基、天冬氨酸残基、苏氨酸残基突变为除了谷氨酰胺残基之外的其它氨基酸。

4、进一步地，所述抗体结合蛋白具有seq id no:2或seq id no:3所示的氨基酸序列。

5、本发明还提供了多聚体，由两个或多个重复单元组成，所述重复单元为所述的抗体结合蛋白。

6、本发明还提供了核酸，所述核酸编码所述的抗体结合蛋白。

7、本发明还提供了重组载体，所述重组载体包括所述的核酸。

8、本发明还提供了宿主细胞，所述宿主细胞包括所述的重组载体。

9、本发明还提供了用于亲和纯化的基质，所述基质负载有所述的抗体结合蛋白或所述的多聚体。

10、本发明还提供了分离抗体igg的方法，利用所述的抗体结合蛋白或所述的多聚体或所述的基质进行分离。

11、本发明还提供了试剂盒，包括所述的抗体结合蛋白或所述的多聚体。

12、本发明至少包括以下有益效果：

13、本发明的抗体结合蛋白由seq id no:1所示的氨基酸序列发生突变得到，经过突变，不仅保持了原有的亲和力和特异性，还提升了碱性耐受性，可长时间承受在位清洗，为工业上抗体的检测、纯化带来了便利，减少了生产成本。

14、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

技术特征：

1.抗体结合蛋白，其特征在于，所述抗体结合蛋白的氨基酸序列由seq id no:1所示的氨基酸序列发生突变得到，所述突变至少包括天冬酰胺残基突变为除了谷氨酰胺残基之外的其它氨基酸。

2.如权利要求1所述的抗体结合蛋白，其特征在于，所述突变还包括甘氨酸残基、天冬氨酸残基、苏氨酸残基突变为除了谷氨酰胺残基之外的其它氨基酸。

3.如权利要求1所述的抗体结合蛋白，其特征在于，所述抗体结合蛋白具有seq id no:2或seq id no:3所示的氨基酸序列。

4.多聚体，其特征在于，由两个或多个重复单元组成，所述重复单元为权利要求1～3任一所述的抗体结合蛋白。

5.核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～3任一所述的抗体结合蛋白。

6.重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求5所述的核酸。

7.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求6所述的重组载体。

8.用于亲和纯化的基质，其特征在于，所述基质负载有如权利要求1所述的抗体结合蛋白或如权利要求4所述的多聚体。

9.分离抗体igg的方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的抗体结合蛋白或如权利要求4所述的多聚体或如权利要求8所述的基质进行分离。

10.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的抗体结合蛋白或如权利要求4所述的多聚体。

技术总结
本发明公开了抗体结合蛋白，所述抗体结合蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列发生突变得到，所述突变至少包括天冬酰胺残基突变为除了谷氨酰胺残基之外的其它氨基酸。本发明还提供了多聚体、核酸、重组载体、宿主细胞、基质、IgG分离方法和试剂盒。本发明的抗体结合蛋具有较好的耐碱性和IgG亲和力。

技术研发人员：肖秀孝,许可,刘鹏飞,郑长龙,赵占勇
受保护的技术使用者：北京达成生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16