用于人AGXT基因编辑的sgRNA及包含其的组合物和应用

本发明涉及基因编辑，尤其是涉及一种用于人agxt基因编辑的sgrna及包含其的组合物和应用。

背景技术：

1、原发性高草酸尿症1型(ph1)是一种儿童期发病的严重疾病，其特点是有多处反复的草酸钙肾结石，并且会发生有进行性肾脏损害。ph1是由agxt基因的遗传缺陷引起的，agxt基因编码肝脏过氧化物酶丙氨酸：乙氧基化物-氨基转移酶(agt)。agt可以将乙醛酸转化为甘氨酸。然而，agxt的突变可导致agt亚细胞定位异常、表达减少甚至不表达。在这种情况下，乙醛酸被乳酸脱氢酶转化为草酸盐，导致内源性草酸积累，肾脏和其他器官中不溶性草酸钙晶体大大增加。由于草酸钙在肾脏组织中的沉积和肾结石的并发症，ph1患者的肾功能会逐渐下降，最终死于终末期肾病或草酸盐中毒的并发症。

2、治疗ph1目前的一个方法是底物还原疗法，这种方法是通过降低代谢途径中乙醇酸氧化酶(go)或乳酸脱氢酶(ldha)的表达来实现的。go由羟酸氧化酶1(hao1)基因编码，负责在过氧化物酶体中催化乙醇酸转化为乙醛酸。而乙醛酸是草酸的代谢前体，通过rna干扰或者基因编辑的方式降低go的表达可以减少乙醇酸向乙醛酸转化，从而减少草酸的产生。在肝脏中，乳酸脱氢酶(ldha)负责乙醛酸到草酸的转化，是草酸代谢的最后一步。通过rna干扰或者基因编辑的方式降低ldh的表达可以减少乙醛酸向草酸的转化，减少草酸的产生。

3、因为减少go或者ldh的表达均能减少草酸的产生，现有的技术利用crispr/cas9系统敲除编码这两个蛋白的基因(hao1和ldha)，从而达到一定的治疗效果。

4、crispr-cas系统首先被确定为细菌中的一种天然抗病毒免疫系统，并逐渐发展成为一种强大的基因编辑工具。根据cas蛋白的特性，crispr/cas系统被分为两大类：第一类和第二类，每一类又可细分为若干类型。第二类crispr/cas9系统是应用最广泛的基因编辑工具。传统的crispr/cas9系统包括的两个组分：cas9核酸酶和一个向导rna(sgrna)。在cas9-sgrna核糖核蛋白复合物形成后，sgrna根据与目标序列的碱基配对，引导这种核糖核蛋白到一个特定的dna序列。cas9含有一个hnh结构域和一个ruvc结构域，在一个短序列(protospacer adjacent motif或pam)存在的情况下，分别剪切sgrna-互补链和非互补链，产生双链断裂(dsb)。dsbs的产生激活了内源性dna修复途径以实现基因编辑。传统的crispr/cas介导的基因组编辑依赖于dsb的产生和随后的内源性细胞dna修复途径，通常包括非同源末端连接(nhej)和同源定向修复(hdr)。nhej是主要的修复方式，在靶标的基因组上产生缺失、插入等突变，破坏基因表达。

5、但是以go或者ldh作为治疗靶点具有如下缺陷：

6、(1)关于靶点的缺点：以往治疗靶点是正常表达的hao1或ldha基因，对这两个基因的敲除会导致其正常功能受到影响，具有不可预测的风险。

7、(2)关于治疗效果的缺点：利用crispr/cas敲除这两个基因虽然可以达到一定的治疗效果，但是研究显示这种治疗效果需要较高的敲除效率(30％左右甚至更高)。

8、(3)关于基因编辑工具的缺陷：crispr/cas系统是利用产生dsb的机制来实现相关基因的敲除的，产生dsb(双链断裂)具有一定的风险，可能会造成染色体易位(染色体易位是编辑位点与其他染色体上的dsb发生连接产生的异常产物，靶向位点倾向于与cas9的脱靶位点以及基因转录活跃区域发生连接，并与染色质三维结构相关)。染色体易位是一种危险的染色体结构变异，常常与血液和神经相关肿瘤的发生相关联；除此之外，cas9还可能会在编辑位点处造成数百bp至数百kb长度的染色体大片段缺失，这种副产物会造成遗传物质的缺失。

9、因此，如何改进ph1的治疗产品，是目前有待解决的问题。

10、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种用于人agxt基因编辑的sgrna，该sgrna能够高效的引导含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的蛋白靶向靶序列。

2、本发明的第二目的在于提供一种用于人agxt基因编辑的组合物，该组合物可以实现对agxt基因进行编辑。

3、本发明的第三目的在于提供一种非诊断和治疗目的的编辑人agxt基因的方法。

4、本发明的第四目的在于提供一种上述sgrna，或上述组合物在制备用于预防、缓解或治疗原发性高草酸尿症1型的产品中的应用，以缓解现有技术中存在的ph1治疗效果不佳的技术问题。

5、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

6、根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于人agxt基因编辑的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列包含如下(a)～(c)中的至少一种：

7、(a)seq_1～38所示核苷酸序列；

8、(b)与seq_1～38所示核苷酸序列至少具有17个、18个、19个或20个相同的连续核苷酸组成的核苷酸序列；

9、(c)与seq_1～38所示核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。

10、优选地，所述sgrna的核苷酸序列包含如下(a)～(c)中的至少一种：

11、(a)seq_2和seq_16所示核苷酸序列；

12、(b)与seq_2或seq_16所示核苷酸序列至少具有17个、18个、19个或20个相同的连续核苷酸组成的核苷酸序列；

13、(c)与seq_2或seq_16所示核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。

14、优选地，所述sgrna的核苷酸序列还包括骨架部分；

15、优选地，所述骨架部分包括发夹区的保守部分和连结区的保守部分；

16、优选地，所述骨架部分的核苷酸序列如seq_39所示。

17、优选地，所述sgrna经修饰；所述修饰包括核苷酸修饰、核苷酸间修饰、5'端修饰和3'端修饰、糖修饰、糖-核苷酸间连接键修饰及其组合组成的组的修饰。

18、根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种用于人agxt基因编辑的组合物，其特征在于，包含：

19、(i)权利要求1～4任一项所述的sgrna；或，含有编码所述权利要求1～4任一项所述的sgrna的核酸；

20、和，(ii)含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的蛋白；或，含有编码所述含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的蛋白的核酸。

21、优选地，所述引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域来源于cas核酸酶；

22、优选地，所述cas核酸酶为cas9核酸酶；

23、优选地，所述cas9核酸酶包括spcas9、hf cas9、sacas9、fncas9、st1cas9、st3cas9、nme1cas9、nme2cas9、cjcas9和sccas9；

24、优选地，所述cas核酸酶包含对应于seq_40所示cas核酸酶中d10a突变或h840a突变的突变及其变体。

25、优选地，所述蛋白为融合蛋白，所述融合蛋白还包括腺嘌呤脱氨酶域或胞嘧啶脱氨酶域；

26、优选地，所述胞嘧啶脱氨酶域选自apobec1、apobec2、apobec3a、apobec3b、apobec3c、apobec3d、apobec3f、apobec3g、apobec3h、apobec4、激活诱导的脱氨酶或pmcda1；

27、优选地，所述腺嘌呤脱氨酶选自tada6.3、tada6.8、tada6.9、tada7.10或tada8e。

28、优选地，还包括用于将所述组合物递送到作用部位的载体；

29、优选地，所述载体包括病毒载体、纳米脂质体和类病毒颗粒中的至少一种；

30、优选地，所述病毒载体包括腺相关病毒、腺病毒和慢病毒中的至少一种。

31、根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种非诊断和治疗目的编辑人agxt基因的方法，该方法包括向受试者递送上述sgrna，或上述组合物。

32、根据本发明的一个方面，本发明还提供了上述sgrna，或上述所述的组合物在制备用于预防、缓解或治疗原发性高草酸尿症1型的产品中的应用。

33、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

34、本发明提供的sgrna靶向人agxt基因的效率高，能够显著提高基因编辑效率。将上述sgrna，或含有其的用于人agxt基因编辑的组合物在制备用于预防、缓解或治疗原发性高草酸尿症1型的产品中的应用，经实验验证，与hao1和ldha等上游基因的敲除相比，校正突变的agxt是最佳治疗策略。突变的agxt基因中约13％的修复率可以达到显著的疗效，优于hao1或ldha基因的缺失，后者至少需要20～40％的编辑效率。