一种牛高原适应育种10K液相芯片及应用

本发明涉及基因组育种领域，具体说是一种选育具有适应高原的10k snp测序分型液相芯片及应用。

背景技术：

1、靶向测序基因型检测(genotyping by target sequencing,gbts)技术是一种新型的用于基因分型的检测技术，可用于动植物和微生物等遗传变异及基因型检测，并广泛应用于分子标记辅助选择、种质资源评价、基因定位与克隆、遗传图谱构建等领域。gbts包括多重pcr的靶向测序基因型检测技术(genoplexs)和液相探针杂交的靶向基因型检测技术(genobaits)，两种技术均可实现对基因组任意位置、任意长度区段的精准捕获，可同时检测ssr、snp、indel等多种遗传变异。gbts可具有更强的目标性，更高的位点覆盖度和样品均一性，从大量基因组dna中挑选到特定靶向位点，进行测序和基因型检测。

2、高原低氧适应是世居高原的物种为适应高原低氧环境所产生的不可逆但稳定遗传的一系列形态结构及生理生化的改变过程。高原低氧适应的血液生理机制主要体现在红细胞数量、血红蛋白浓度、氧结合力等方面的变化，藏猪(kong et al.2019)、藏绵羊(weiet al.2016；liu et al.2020)、藏鸡(nie et al.2005)和牦牛(wu et al.2015)在内的家养动物进化出了独特的生理特征，如优越的血氧运输系统和高代谢效率，以适应低氧的生活压力。

3、西藏牛改良始于上世纪80年代，目前改良西藏牛(荷斯坦牛♂×西藏牛♀)级进杂交已进行到f3代以上。经过40多年的级进杂交，“黄改奶”覆盖率达到80％，在改良的数量与质量上都实现了历史性突破。随着改良代次增加，改良西藏牛的生产性能得到了一定程度的提高，如生长速度、产奶量和瘦肉率等。随着级进杂交的持续进行，西藏牛血缘所占比重越来越低，高代次的杂交后代高原适应性明显降低，死亡率达20％左右，而产奶量仅2300kg左右。因此，目前在改良西藏牛选育中尚未有可用的商业化snp芯片，必须开展改良群体的横交固定和世代选育，挖掘西藏牛低氧适应的基因和位点，保留其高原适应的优良血统，通过分子育种手段可快速选育低氧耐受个体。

技术实现思路

1、本发明对连续海拔牛群体进行全基因组测定，鉴定牛低氧适应相关的海拔关联位点，并对改良西藏牛第三代个体进行了血液生理和血流变指标与高原适应snp位点的全基因组关联分析。初步设计和开发了包含10k位点数目的液相芯片，以期为开展牛抗逆性状等遗传育种工作提供高效可靠的技术手段，方便快速且低成本，减少选育过程中世代间隔长的问题，为养殖场带来更大的经济效益。

2、为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

3、本发明第一方面提供了一种牛高原适应育种10k液相芯片，包含11637个用于探针设计的snp位点，所述用于探针设计的snp位点信息如表1所示，参考基因组的全基因组序列的版本号为：bos taurus umd 3.1。

4、该牛高原适应育种10k液相芯片中snp位点通过如下方法获得：首先，通过连续海拔牛种群体基因组学分析筛选与海拔相关联的基因和位点，具体方法：通过fst(3500-500m)、memea和baypass三种分析方法对连续海拔牛种进行群体基因组学分析，筛选与海拔相关联的基因和位点；进一步优选，连续海拔是指500m(盈江、大麦地)、1500m(腾冲)、2500m(丽江)、3000m(迪庆)和3500m(工布江达)，牛种为黄牛；其次，基于这些关联位点创制液态育种芯片；最后，基于现存的回交和横交的高代次杂交分离群体，系统测定低氧相关血液生理系列指标，利用该芯片实施低氧生理的全基因组关联分析(gwas)案例，进一步挖掘低氧生理关联位点，验证和改善芯片的可靠性。研究结果可为解决目前高原牛选育所面临的低氧瓶颈提供分子途径。

5、本发明第二方面提供了牛高原适应育种10k液相芯片的基因分型方法，包括如下步骤：

6、(1)dna提取：提取待测牛的血液dna，对提取后的dna样品进行dna的纯度和完整性检测，以及对dna浓度进行准确定量；

7、(2)genobaits实验流程：将质检合格的dna利用超声波破碎仪进行随机物理破碎，破碎片段峰值控制在200-300bp，破碎后的dna经过末端修复后连接a尾；利用连接酶将加a后的dna片段与测序接头连接在一起，然后利用羧基修饰的磁珠对文库进行纯化和片段选择，保留插入片段在200-300bp的连接产物；连接产物加入带有barcode的测序引物和高保真pcr反应体系进行pcr扩增，不同的barcode用于区分不同的样品；经过羧基磁珠纯化后扩增产物，即可用于探针杂交实验。

8、(3)文库构建及上机测序：取完成构建的测序文库，冻干后加入探针与杂交试剂，变性后置于65℃温育2小时即可完成杂交反应；杂交产物进行洗液清洗后，再进行一轮pcr完成杂交捕获文库的构建，使用qubit2.0进行初步定量，使用qpcr的方法对文库的有效浓度进行准确定量以保证文库质量；文库检测合格后，进入上机测序阶段，最终获得目标snp的基因型。

9、本发明第三方面提供了第一方面所述的液相芯片在西藏牛的基因型检测、全基因组关联分析、全基因组选择育种中的应用。

10、本发明的有益效果：

11、本发明以连续海拔牛的群体基因组学分析为基础，鉴定与海拔关联的基因和位点，挖掘西藏牛高原适应位点，基于这些海拔关联位点创制了一款具有低成本高通量基因分型液相芯片(10k)。根据现存的回交和横交的高代次杂交分离群体，系统测定低氧相关血液生理指标，利用该10k snp芯片实施低氧生理的全基因组关联分析(gwas)案例，进一步挖掘低氧生理关联位点，验证和改善芯片的可靠性。本发明可解决高原牛选育所面临的低氧瓶颈问题，并为选育高原耐受个体提供快速精准的分子手段，并为开展牛抗逆性状选育等相关遗传育种工作提供可靠的技术平台，促进我国高原牛业发展，同时也为其他高原动物的选育提供理论参考和方法指导。

技术特征：

1.一种牛高原适应育种10k液相芯片，其特征在于：所述牛高原适应育种10k液相芯片包含11637个用于探针设计的snp位点，所述用于探针设计的snp位点信息如表1所示，参考基因组的全基因组序列的版本号为：bos taurus umd 3.1。

2.根据权利要求1所述一种牛高原适应育种10k液相芯片，其特征在于：所述芯片通过下述方法获得：

3.如权利要求1所述牛10k液相芯片在牛的基因型检测、全基因组关联分析、全基因组选择育种中的应用。

4.如权利要求1所述的一种牛高原适应育种10k液相芯片的基因分型方法，其特征在于：包括如下步骤：

技术总结
本发明涉及一种牛高原适应育种10K液相芯片及应用，属于基因组育种领域，包括（1）牛全基因组范围的10K SNP芯片的开发：通过连续海拔牛的群体基因组学鉴定牛海拔关联位点，标记筛选出牛高原适应的10K SNP位点，液相芯片的设计和探针的设计，进而获得10K的液相芯片；（2）提供了一款具有低成本高通量基因分型液相芯片（10K），芯片的准确性和分型效果高，可解决高原牛群选育所面临的高原适应性问题，可为选育高原耐受个体提供快速精准的分子手段，并为开展牛抗逆性状选育等相关遗传育种工作提供可靠的技术平台，促进我国高原牛业发展，同时也为其他高原动物的选育提供理论参考和方法指导。

技术研发人员：苟潇,杨舒黎,倪彬,高乐程,张康,聂泓宇,叶泽宇,王怡文
受保护的技术使用者：佛山科学技术学院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17