一种链霉亲和素及其纯化方法与流程

本发明属于分子生物学，具体涉及一种链霉亲和素及其纯化方法。

背景技术：

1、链霉亲和素(streptavidin，简称sa)是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质，链霉亲和素具有与生物素特异性结合的能力，并能与过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光基团等结合，在wb、ihc、ish、流式细胞术、化学发光领域发挥着巨大的作用。

2、链霉亲和素是由四个分子量16kd的亚基构成的四聚体蛋白，分子量约为64kda，等电点6.0，一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，其与生物素的解离常数接近1015m，是一种非常完美的生物素结合蛋白，同时对生物素类似小分子也有广泛的结合能力。

3、链霉亲和素是由多个β折叠形成的桶装结构，其结合生物素位点位于桶装结构开口处。链霉亲和素与生物素通过氢键及疏水作用广泛结合。其中79、92、108的trp(slate)对链霉亲和素疏水结合起到关键作用。23位的asn、27位的ser、43位的tyr、45位的ser、128位的asp对结合生物素的氢键结合贡献巨大。

4、链霉亲和素虽然在结合生物素方面表现优异，但链霉亲和素目前的纯化工艺相对繁琐，同时产量较低。工业上目前常采用变复性的方式纯化蛋白，纯化周期及纯化材料消耗较大。找到一种同生物素结合能力相近，纯化步骤简单高效的链霉亲和素对生物学领域具有重要的意义。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供一种链霉亲和素、制备及其纯化方法。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种链霉亲和素，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明的进一步优选，上述链霉亲和素氨基酸序列密码子优化：以大肠杆菌作为表达菌株，通过sequence manipulation suite(version2)优化。优化后核苷酸序列如seqid no.2所示。

4、本发明的进一步优选，上述链霉亲和素表达载体为pet28a。

5、本发明的进一步优选，上述链霉亲和素表达菌株为bl21或de3。

6、上述链霉亲和素的制备及纯化方法，包括如下步骤：

7、1.人工基因合成及定点突变引入：依据链霉亲和素氨基酸序列进行改造，将所述链霉亲和素氨基酸序列第17位的vla突变为asn，第45位的ala突变为tyr，第47位的gly突变为ser，第75位的tyr突变为trp，第99位的ala突变为trp，所得氨基酸序列即如seq id no.1所示；

8、2.将在步骤1突变后的氨基酸序列的n端添加met以atg作为起始密码子，将步骤1所述氨基酸序列(seq id no.1)进行密码子优化，并在其后的3’-端添加终止密码子taa；

9、3.将步骤2中得到的序列在华大基因进行合成，得到人工dna序列，将该序列导入pet28a表达载体中，使用bl21(de3)菌株进行表达；

10、4.将步骤3所述表达后的转化细胞进行摇瓶培养，温度37℃，200rpm过夜培养，按照体积比为1％的比例将培养的菌液接种到新鲜的含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、200rpm条件下振荡培养至菌液浓度od600在0.8～1.2，加入诱导物iptg至工作浓度1mm继续培养24小时，4℃、8000rpm条件下离心10min而后收集菌体；离心获得发酵菌体采用sds-page进行表达量测定，选取表达量最高的菌株，进行发酵培养，培养条件37℃、200rpm；离心(8000rpm，10min)获得菌体，之后使用缓冲液pbs进行清洗离心，重复3次。留取菌体在冰上进行超声破碎，破碎buffer为20mm tris ph 7.0；功率200w，超声5s，间隔5s，持续10min，然后进行离心，留取上清；

11、5.将步骤4获得的上清进行阴离子交换纯化，使用阴离子交换的填料为千纯生物科技有限公司的rigose q(1l)，使用低盐buffer 20mm tris ph 7.0进行上样，以5ml/min的流速进行纯化，收集穿出液(flow-through)中的蛋白；该步可使制备出的链霉亲和素jc2纯度达到90％以上；随后将收集到的流穿用5kd的膜包进行浓缩，将样品蛋白体积控制到分子筛柱体积的10％以内；随后使用千纯生物科技有限公司的分子筛pg75(1l)进行精纯脱盐操作，使用pbs ph 7.0上样，以1ml/min的流速对样品进行杂蛋白分离及置换buffer；收集0.85倍柱体积(850ml)处所出的蛋白样品；用5kd的浓缩管将蛋白浓缩至终浓度2mg/ml；使用冻干机将样品冻干成粉末备用；冻干后的蛋白用超纯水溶解至终浓度1mg/ml；用bca法测定蛋白浓度，并进行sds-page电泳检测；平均1l大肠杆菌可纯化得到98％纯度链霉亲和素jc2蛋白170mg。

12、本发明与现有技术相比的有益效果是：(1)本发明分析并确定了链霉亲和素jc2，并且对jc2进行定向突变改造提高其结合生物素的能力；(2)本发明制备的链霉亲和素jc2对比链霉亲和素，同等条件下本发明制备的链霉亲和素jc2产量更高，纯化工艺更简洁，总耗时更短；(3)本发明制备的链霉亲和素jc2相比传统链霉亲和素自身性质更稳定。

技术特征：

1.一种链霉亲和素，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的链霉亲和素，其特征在于，所述链霉亲和素氨基酸序列密码子优化，优化后核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求2所述的链霉亲和素，其特征在于，所述优化方法为：以大肠杆菌作为表达菌株，通过version2版本的sequence manipulation suite优化。

4.根据权利要求2所述的链霉亲和素，其特征在于，所述链霉亲和素表达载体为pet28a。

5.根据权利要求2所述的链霉亲和素，其特征在于，所述链霉亲和素表达菌株为bl21或de3。

6.如权利要求1所述的链霉亲和素，其特征在于，步骤包括：

技术总结
本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种链霉亲和素及其纯化方法。链霉亲和素氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其制备方法步骤包括：人工基因合成及定点突变引入、添加起始密码子、密码子优化、添加终止密码子、合成、序列导入及表达、培养、纯化。本发明分析并确定了链霉亲和素JC2，并且对JC2进行定向突变改造提高其结合生物素的能力。

技术研发人员：丛建铭,李民强,岳敏
受保护的技术使用者：大连博格林生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16