一种高产谷氨酸的酿酒酵母及其应用

：本发明属于生物工程，涉及工业微生物的育种，尤其是一种同时过表pck1、cit2和gdh1基因的高产谷氨酸酿酒酵母工业菌及其构建方法与应用。

背景技术

0、
背景技术：

1、酵母抽提物富含氨基酸、多肽、b族维生素、呈味核苷酸及微量元素，具有纯天然、味道醇厚、营养丰富等诸多优点，广泛应用于食品领域，但其鲜度不够突出(谷氨酸含量不足)。酿酒酵母是我国酵母抽提物产品的主要生产原料，通过代谢工程与合成生物学策略对酿酒酵母进行改造，可以提高酿酒酵母合成谷氨酸的能力。但是，由于酿酒酵母相较于原核生物具有更复杂的氨基酸调控机制，强化以酿酒酵母为平台的氨基酸代谢途径具有很大提升空间，所以通过代谢工程强化酿酒酵母内源氨基酸代谢路径，并过量合成谷氨酸的前体物质，是以低价从头合成氨基酸基化合物的重要前提。

2、cit2编码檬酸合酶编，过表达cit2基因可有效提高柠檬酸合酶活性，从而促进α-酮戊二酸的合成；gdh1编码谷氨酸脱氢酶，可催化α-酮戊二酸和nh4+生成谷氨酸的可逆反应；pck1编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。但目前尚未见将上述基因进行综合改造以提高谷氨酸产量的技术，本发明将以酿酒酵母出发菌株，通过对pck1、cit2和gdh1基因的改造获得一株谷氨酸高产菌株。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明的目的是解决产谷氨酸酵母菌种性能差、谷氨酸含量低的问题，提供一种高产谷氨酸的工业酿酒酵母。

2、为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

3、以酿酒酵母为出发菌株，通过在酿酒酵母出发菌株中同时过表达pck1、cit2和gdh1基因从而获得高产谷氨酸的工业酿酒酵母菌株；

4、优选地，所述出发菌株为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)ay12α，即编号cicc32315的ay12的单倍体α菌株；

5、所述pck1基因的gene id为：853972，序列如seq id no.1所示；

6、所述cit2基因的gene id为：850361，序列如seq id no.2所示；

7、所述gdh1基因的gene id为：854557，序列如seq id no.3所示。

8、本发明的另一目的在于提供上述高产谷氨酸酿酒酵母工程菌的构建方法，所述高产谷氨酸酿酒酵母工程菌，是将gal80过表达位点的上游同源序列、筛选标记基因kanmx、强启动子(pgk1p)、pck1基因、终止子(pgk1t)以及gal80基因的下游同源序列片段进行融合pcr，然后通过醋酸锂化学转化法导入宿主菌株中，增加pck1基因的一个拷贝数且使用强启动子，达到基因过表达的目的；

9、同理，将cit2基因在hxt16过表达位点增加一个拷贝数；再将gdh1使用筛选标记基因hyg通过醋酸锂化学转化法转入待改造的菌株中，实现在yml059c过表达位点增加一个拷贝数。

10、具体步骤如下：

11、(1)pcr扩增pgk1启动子(pgk1p)、pgk1终止子(pgk1t)和kanmx片段；pcr扩增pck1基因及gal80位点的上、下游同源序列(gal80-ba、gal80-bb)，将gal80上游同源序列、pgk1p、pck1基因、pgk1t、kanmx、下游同源序列进行融合pcr，形成gal80-ba+pgk1p、pck1基因、和pgk1t+kanmx+gal80-bb三个片段，通过醋酸锂转化法将上述片段转化到宿主菌株，并筛选得到过表达pck1基因的工程菌；

12、(2)剔除筛选标记kanmx；

13、(3)扩增得到kanmx片段，pcr扩增得到cit2基因及hxt16过表达位点的上、下游同源序列片段，将hxt16位点的上游同源序列(hxt16-ba)、pgk1p、cit2基因、pgk1t、kanmx、下游同源序列(hxt16-bb)片段进行融合pcr，形成hxt16-ba+pgk1p、cit2基因、和pgk1t+kanmx+hxt16-bb三个片段，采用醋酸锂化学转化法将上述片段转化到步骤(2)获得的工程菌中，筛选得到在过表达pck1基因的基础上同时过表达cit2基因的改造菌；

14、(4)pcr扩增得到hyg片段，pcr扩增得到gdh1基因、hyg片段及yml059c位点的上、下游同源臂片段，将yml059c位点的上游同源臂(yml059c-ba)、pgk1p、gdh1基因、pgk1t、hyg、下游同源臂片段(yml059c-bb)进行融合pcr，形成yml059c-ba+pgk1p、gdh1基因、和pgk1t+hyg+yml059c-bb三个片段，采用醋酸锂化学转化法将上述片段转化到步骤(3)获得的菌株中，筛选得到在过表达pck1、cit2基因的基础上再过表达gdh1基因的改造菌。

15、本发明的另一目的是提供上述高产谷氨酸酿酒酵母工程菌在生产谷氨酸中的应用。

16、优选地，采用所述高产谷氨酸酿酒酵母工程菌发酵产谷氨酸的方法如下：

17、种子液培养：用接种环在斜面上挑取一环酿酒酵母工程菌菌泥接种到蔗糖液体培养基试管中，在30℃、200rpm摇床中培养10h，得到种子液；

18、发酵培养：将种子液按照接种量10％(体积百分比)接种于蔗糖液体培养基中，30℃、200rpm条件下发酵培养12h；

19、进一步地，所述蔗糖液体培养基组成为：蔗糖10％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％，硫酸亚铁0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸铵1.32％，硫酸镁0.1％，其余为水，ph自然。

20、有益效果：

21、1、本发明提供的高产谷氨酸酿酒酵母菌株能够在保持良好发酵性能的前提下，同时过表达pck1、cit2和gdh1基因，提高了酵母胞外谷氨酸含量。

22、2、本发明选育得到的酿酒酵母ay1、ay2、ay3谷氨酸含量分别为83.80mg/l、396.92mg/l、555.19mg/l，亲本菌株ay12α谷氨酸含量为132.93mg/l，相比于亲本菌株，ay1谷氨酸含量降低到了原来的63％，其余两个菌株分别提高了1.99倍、3.18倍。

技术特征：

1.一种生产谷氨酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，通过在酿酒酵母出发菌株中同时过表达pck1、cit2和gdh1基因获得。

2.如权利要求1所述的一种生产谷氨酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，出发菌株为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)ay12α。

3.如权利要求1所述的一种生产谷氨酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述pck1基因的序列如seq id no.1所示；所述cit2基因的序列如seq id no.2所示；所述gdh1基因的序列如seq id no.3所示。

4.权利要求1所述酿酒酵母工程菌在生产谷氨酸中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，采用所述酿酒酵母工程菌发酵产谷氨酸的方法如下：

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种同时过表PCK1、CIT2和GDH1基因的高产谷氨酸酿酒酵母工业菌及其构建方法与应用。本发明提供的高产谷氨酸酿酒酵母菌株能够在保持良好发酵性能的前提下，提高了酵母胞外谷氨酸含量，AY3菌株谷氨酸产量达到555.19mg/L，是亲本菌株的3.18倍。

技术研发人员：郭学武,霍巧娟,赵东,宾志强,陈叶福,肖冬光
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16