一种诱导猪多能性细胞的诱导剂以其构建方法与应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种诱导猪多能性细胞的诱导剂以其构建方法与应用。

背景技术：

1、胚胎干细胞(embryonic stem cells，esc)作为一种发育生物学模型，可用于研究胚胎发育过程中的关键调控因子和分子机制，还可以诱导分化出具有特定功能的细胞和组织，在医药产品和再生医学的研发中可发挥重要作用。但与小鼠和人的esc建立不同，大型哺乳动物的esc很难获得和维持。

2、猪是重要的家畜，鉴于它们在器官解剖、生理和代谢方面与人类相似，可以作为理想的医学模型。猪多能干细胞的产生在开发疾病模型、实现异种移植和改善其生产特性方面发挥着重要作用。然而，猪esc的获得面临许多挑战，到目前为止还没有建立真正的猪esc。已发表的细胞系通常不符合严格的多能性标准，被称为“es样”细胞。没有明确的培养体系，且有效性较低。目前，猪esc的鉴定标准仍然参考于小鼠或人类胚胎干细胞的标准。所获得的细胞在体外培养条件下难以实现长期稳定生长，许多临床应用和猪的复杂转基因修饰无法推进。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，ipsc)的出现为猪的干细胞工作带来了新的希望。

3、通过使用多能性基因重新编程体细胞(如成纤维细胞)产生的ipsc，表现出类似于esc的多能性表型，而且相对esc来说更容易获得，被认为是药理学、生物医学、毒理学和细胞治疗的有力工具。将ipsc与克隆技术相结合，可能有助于解析复杂的基因机制。但在ipsc诱导过程中，存在着外源基因对基因组的整合问题，这不利于ipsc在疾病相关领域的研究和临床应用。

4、在最初的研究中，使用逆转录病毒以及慢病毒载体进行诱导，诱导型慢病毒的使用可以控制重编程因子在诱导过程中的表达时间。后来在选择病毒时使用非整合病毒诱导ipsc的产生，腺病毒是一种常被使用的非整合型载体，然而使用腺病毒诱导ipsc具有诱导效率非常低的问题。为了获得无病毒的方式实现重编程，yamanaka通过质粒载体实现重编程因子的瞬时表达，同时通过维持长时间的转基因表达来提高转染效率，获得小鼠ipsc。但实验显示，ipsc克隆中有一些基因没有整合到基因组中。cre-loxp和pb转座子可去除基因整合位点的外源性重编程因子，但载体和loxp位点仍保留在基因组中，存在中断启动子和编码序列等隐患，ipsc也可以通过使用修饰mrna来实现重编程因子的长时间高表达，从人和小鼠成纤维细胞中有效获得，但rna是不稳定的。添加一些化学小分子和外源成分改变培养条件也可能提高ipsc重编程的效率，或在ipsc诱导中取代一种或多种重编程转录因子。邓宏魁实验组利用7个小分子从小鼠体细胞中得到化学诱导的ipsc，还有许多其他化学小分子能够提高ipsc的诱导效率，在ipsc的产生过程中发挥作用，小分子刺激的方式简单且高度可控。然而，鉴于稳定的表观修饰和可塑性较低的情况，人类和猪等大型哺乳动物的体细胞对化学刺激不敏感，因此很难通过化学重编程诱导ipsc。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了提供一种利用表达内源性重编程因子获得多能性细胞的方法。

2、本发明提供一种诱导猪多能性细胞的诱导剂，所述诱导剂为以cas12a-activ载体作为基础载体骨架，将oct4、sox2、cmyc、klf4、ctnnb1、dnmt3l、tcl1、sall4、nanog、fbxo15、eras、dppa2、dppa3、grb2、dppa4、dppa5、fthl17、rex1、ecat1、ecat8、sox15、stat3、utf1和gdf3基因的sgrna串联合成一个片段s24，然后连接到基础载体骨架中获得cas12a-activ-24重组载体或以cas12a-activ载体作为基础载体骨架，将oct4、sox2、klf4、cmyc、nanog、ctnnb1、eras、fbox15、tcl1和dppa2基因的sgrna串联合成一个片段是s10，然后连接到基础载体骨架中获得cas12a-activ-10重组载体。

3、进一步地限定，oct4基因的gene id为100127461；sox2基因的gene id为407739；cmyc基因的gene id为448810；klf4基因的gene id为595111、ctnnb1基因的gene id为397657、dnmt3l基因的gene id为100621554、tcl1基因的gene id为100156364、sall4基因的gene id为100136902、nanog基因的gene id为106507523、fbxo15基因的gene id为100516237、eras基因的gene id为100621986、dppa2基因的gene id为100620381、dppa3基因的gene id为100511328、grb2基因的gene id为100192436、dppa4基因的gene id为100620290、dppa5基因的gene id为100301558、fthl17基因的gene id为100154515、rex1基因的gene id为100627512、ecat1基因的gene id为100738024、ecat8基因的gene id为102162257、sox15基因的gene id为100522397、stat3基因的gene id为733648、utf1基因的gene id为100158138和gdf3基因的gene id为100510963。

4、本发明提供上述诱导剂在诱导猪成纤维细胞重编程为猪多能性细胞中的应用。

5、本发明提供上述诱导剂在激活基因的有效性中的应用。

6、本发明提供构建上述的诱导剂的方法，其特征在于，所述的方法如下：

7、(1)构建cas12a-activ-24重组载体的方法：24个基因的sgrna串联片段s24合成后，使用s24+ha-f和s24+ha-r引物对s24基因片段进行pcr扩增，此pcr反应会对s24基因片段两端加上同源臂，扩增后获得ha-s24-ha dna片段；

8、(2)使用bsmbi限制性内切酶对cas12a-activ载体骨架进行酶切，经电泳分离胶回收，制备得到cas12a-activ骨架dna与ha-s24-ha dna片段后，通过同源重组的方式将24个基因的sgrna串联片段s24连入cas12a-activ载体获得cas12a-activ-24重组载体；

9、或

10、1)构建cas12a-activ-10重组载体的方法：10个基因的sgrna串联片段s10合成后，使用s10+ha-f和s10+ha-r引物对s10基因片段进行pcr扩增，此pcr反应会对s10基因片段两端加上同源臂，扩增后获得ha-s10-ha dna片段；

11、2)使用bsmbi限制性内切酶对cas12a-activ载体骨架进行酶切，经电泳分离胶回收，制备得到cas12a-activ骨架dna与ha-s10-ha dna片段后，通过同源重组的方式将10个基因的sgrna串联片段s10连入cas12a-activ载体，构建cas12a-activ-10多基因激活载体。

12、进一步地限定，s24+ha-f和s24+ha-r引物序列如seq id no.44和seq id no.45所示；s10+ha-f和s10+ha-r引物如seq id no.42和seq id no.43所示。

13、进一步地限定，片段s24的序列为seq id no.40；片段s10的序列为seq id no.1。

14、本发明提供一种诱导猪多能性细胞的方法，所述的方法具体的步骤如下：

15、步骤1：构建重组载体：以cas12a-activ载体作为基础载体骨架，将oct4、sox2、cmyc、klf4、ctnnb1、dnmt3l、tcl1、sall4、nanog、fbxo15、eras、dppa2、dppa3、grb2、dppa4、dppa5、fthl17、rex1、ecat1、ecat8、sox15、stat3、utf1和gdf3基因的sgrna串联合成一个片段s24，然后连接到基础载体骨架中获得cas12a-activ-24重组载体；

16、或者以cas12a-activ载体作为基础载体骨架，将oct4、sox2、klf4、cmyc、nanog、ctnnb1、eras、fbox15、tcl1和dppa2基因的sgrna串联合成一个片段s10，然后连接到基础载体骨架中获得cas12a-activ-10重组载体；

17、步骤2：将步骤1中获得的重组载体对猪成纤维细胞进行转染培养后，诱导获得多能性细胞。

18、进一步地限定，oct4基因的sgrna如seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4所示、sox2基因的sgrna如seq id no.5、seq id no.6或seq id no.7所示、cmyc基因的sgrna如如seq id no.11、seq id no.12或seq id no.13所示、klf4基因的sgrna如如seq idno.8、seq id no.9或seq id no.10所示、ctnnb1基因的sgrna如seq id no.16或seq idno.17所示、dnmt3l基因的sgrna如seq id no.28所示、tcl1基因的sgrna如seq id no.24或seq id no.25所示、sall4基因的sgrna如seq id no.33所示、nanog基因的sgrna如seq idno.14或seq id no.15所示、fbxo15基因的sgrna如seq id no.18或seq id no.19所示、eras基因的sgrna如seq id no.20或seq id no.21所示、dppa2基因的sgrna如seq idno.22或seq id no.23所示、dppa3基因的sgrna如seq id no.37所示、grb2基因的sgrna如seq id no.39所示、dppa4基因的sgrna如seq id no.32所示、dppa5基因的sgrna如seq idno.27所示、fthl17基因的sgrna如seq id no.36所示、rex1基因的sgrna如seq id no.34所示、ecat1基因的sgrna如seq id no.26所示、ecat8基因的sgrna如seq id no.29所示、sox15基因的sgrna如seq id no.31所示、stat3基因的sgrna如seq id no.38所示、utf1基因的sgrna如seq id no.35所示和gdf3基因的sgrna如seq id no.30所示。

19、进一步地限定，步骤2中培养的时间是2-4天。

20、有益效果：利用crispr/cas12a介导的多基因调控优势，应用crispr/cas12a内源激活系统，对猪的成纤维细胞进行诱导，通过靶向24个多能性相关的基因的启动子区域，如oct4、sox2和nanog等在维持多能性方面发挥作用的基因，stat3、eras、cmyc、klf4和ctnnb1等一些被证明有助于细胞表型的长期维持和快速增殖的基因，以及几种在胚胎干细胞中特异性表达的基因。将24个多能性相关的基因进行内源激活，成功将pef细胞重编程为具有多能性的细胞。

21、在利用cas12a-activ-24、cas12a-activ-10、cas12a-activ-4多基因激活载体进行不同基因组合的诱导过程中发现，24个基因：oct4、sox2、cmyc、klf4、ctnnb1、dnmt3l、tcl1、sall4、nanog、fbxo15、eras、dppa2、dppa3、grb2、dppa4、dppa5、fthl17、rex1、ecat1、ecat8、sox15、stat3、utf1、gdf3的同时激活可以使pef细胞具有多能性，证实在猪成纤维细胞上进行内源激活诱导是具有可行性的。10个基因：oct4、sox2、klf4、cmyc、nanog、ctnnb1、eras、fbox15、tcl1、dppa2的同时激活可以使pef细胞具有初步的多能性，但不能够维持克隆形态。4个基因：oct4、sox2、klf4、cmyc的同时激活没能成功将pef进行诱导。