一种棉花组成型强启动子PGhFDH-Pro及其应用

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种棉花组成型强启动子pghfdh-pro及其应用。

背景技术：

1、棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是我国主要的经济作物之一。棉花具有纺织、产油、蜜源等多种用途，我国是棉花生成和消费大国，棉花生产在我国国民经济中占有重要的地位。近年来，植物组织器官和发育特异性表达的研究成为植物分子生物学的一个重要研究领域，特别是在植物基因工程的实用化阶段中，为了使目的基因在特定的组织器官和特定的发育阶段优先表达，对组织特异性表达的研究更是成为热点。由于棉花纤维的发育直接影响纤维的品质和产量，因此，研究和筛选特异表达的启动子不仅有助于解析基因表达调控的分子机制，并可为植物基因工程提供有用的调控元件。

2、启动子是一段位于结构基因5'端上游区的dna序列，可以与rna聚合酶特异性结合与识别，并且可以调控转录的起始。启动子序列结构中存在多个作用元件，因此启动子的研究对于研究表达调控、植物基因工程及表达目的蛋白有着重要的意义。目前，组成型camv35s启动子在棉花基因工程中被大量使用，但由于其本身存在一定的缺陷，导致实验未能出现预期的结果。因此分离鉴定新型高效的能够在棉花中驱动的启动子，在棉花分子育种中将具有重要的应用价值。

3、根据启动子的作用方式和功能，植物基因工程中常用的启动子可以分为3类：组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子能够驱动内源或者外源基因在植物的所有组织及全生育期持续表达，对于某个目标基因的表达基因重要的意义。目前在植物基因中应用较为广泛的组成型启动子包括camv 35s(odell et al.,1985)、nos(marton et al.,1979)和actin(christensen et al.,1992)等，其中camv 35s启动子是在植物转基因应用中的主要启动子。组成型启动子具有诸多优点，如研究充分、易于获取、表达稳定、调控不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，在植物基因工程中最为广泛的应用价值。然而，组成型启动子具有一些局限性，外源基因的组成型表达使大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，植物原有的代谢平衡被扰乱，或者一些有毒代谢产物阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。因此，植物内源的组成型启动子的可用性对于用于植物遗传转化的成功具有重要作用。

4、鉴定植物的组成型启动子，对于棉花转基因工程的应用来说，是一个重要且广泛的重要资源。虽然目前已从不同植物克隆到了不同类型的启动子，但棉花中能够中高效表达的内源组成型启动子的克隆及应用报道较少。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供一种棉花组成型强启动子pghfdh-pro及其应用，该强启动子pghfdh-pro能够特异地驱动外源基因在棉花不同生长阶段不同器官中强烈表达，为植物基因工程的应用提供了一个良好的资源，为应用于植物性状改良的转基因研究奠定了基础。

2、本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

3、本发明的第一方面在于提供了一种棉花组成型强启动子pghfdh-pro，所述强启动子pghfdh-pro的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明的第二方面在于提供了含有上述强启动子pghfdh-pro的表达载体。

5、在一些实施方式中，所述表达载体为植物表达载体，所述植物表达载体为pghfdh-pro::gus。

6、本发明的第三方面在于提供了上述表达载体的构建方法，所述构建方法如下：

7、以棉花基因组dna为模板，使用扩增引物进行pcr扩增，得到的pcr产物片段经过ta克隆连接到t载体上，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到pghfdh-pro质粒；

8、将棉花pghfdh-pro的启动子构建到携带gus基因植物表达载体pgwb433上的，先将测序正确的pghfdh-pro的启动子序列连接到pdonorzeo中间载体上进行bp反应，测序正确后进行lr反应，然后将目的片段置换到植物表达载体pgwb433上。

9、在一些实施方式中，所述扩增引物包括：

10、m13f的序列如seq id no.2所示；

11、m13r的序列如seq id no.3所示；

12、bp-pghfdh-pro-f的序列如seq id no.4所示；

13、bp-pghfdh-pro-r的序列如seq id no.5所示；

14、gus-r的序列如seq id no.6所示。

15、本发明的第四方面在于提供了上述棉花组成型强启动子pghfdh-pro在制备转基因植物中的应用，所述转基因植物为棉花或拟南芥。

16、本发明的第五方面在于提供了上述表达载体在制备转基因植物中的应用，所述转基因植物为棉花或拟南芥。

17、本发明具有以下有益效果：

18、(1)本发明提供了棉花组成型强启动子pghfdh-pro，该启动子具有启动子基本的组成元件活性，可以驱动下游外源基因在转基因拟南芥及棉花的各个组织中表达，表明了该启动子是一个组成型强启动子；

19、(2)经验证，本发明的棉花组成型强启动子pghfdh-pro在叶片、茎秆、花瓣、花药、胚、种子及不同纤维发育时期都具有很高的gus活性，说明该启动子具有非常强大的功能，在未来棉花乃至其他植物的基因工程的应用提供了一个良好的资源，为应用于植物性状改良的转基因研究奠定了基础。

技术特征：

1.一种棉花组成型强启动子pghfdh-pro，其特征在于，所述强启动子pghfdh-pro的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.含有如权利要求1所述强启动子pghfdh-pro的表达载体。

3.根据权利要求2所述强启动子pghfdh-pro的表达载体，其特征在于，所述表达载体为植物表达载体，所述植物表达载体为pghfdh-pro::gus。

4.根据权利要求2或3所述强启动子pghfdh-pro的表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：

5.根据权利要求4所述强启动子pghfdh-pro的表达载体的构建方法，其特征在于，所述扩增引物包括：

6.根据权利要求1所述的棉花组成型强启动子pghfdh-pro在制备转基因植物中的应用，其特征在于，所述转基因植物为棉花或拟南芥。

7.根据权利要求2或3所述的表达载体在制备转基因植物中的应用，其特征在于，所述转基因植物为棉花或拟南芥。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种棉花组成型强启动子PGhFDH‑Pro及其应用，强启动子PGhFDH‑Pro的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还以棉花基因组DNA为模板，使用扩增引物进行PCR扩增，PCR产物片段经过TA克隆连接到T载体上，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到PGhFDH‑Pro质粒，将棉花pGhFDH‑Pro的启动子构建到携带GUS基因植物表达载体pGWB433上的，先将测序正确的pGhFDH‑Pro的启动子序列连接到pDONORzeo中间载体上进行BP反应，测序正确后进行LR反应，然后将目的片段置换到植物表达载体pGWB433上，得到含有强启动子PGhFDH‑Pro的表达载体。本发明的强启动子PGhFDH‑Pro能够特异地驱动外源基因在棉花不同生长阶段不同器官中强烈表达，为植物基因工程的应用提供了一个良好的资源，为应用于植物性状改良的转基因研究奠定了基础。

技术研发人员：李波,足木热木.吐尔逊,杨洋,李晓荣,陈果,蔡大润,陈勋基,李娟,刘志刚
受保护的技术使用者：新疆农业科学院核技术生物技术研究所（新疆维吾尔自治区生物技术研究中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15