近平滑念珠菌唑类耐药相关的新突变位点及其应用

本技术涉及真菌耐药机制以及耐药快速检测的，更具体地说，涉及近平滑念珠菌唑类耐药相关的新突变位点及其应用。

背景技术：

1、近平滑念珠菌是一种全球范围内引起侵袭性念珠菌病的临床重要致病性真菌。唑类药物是预防或治疗侵袭性念珠菌病的常用药物。近平滑念珠菌对唑类药物的耐药情况严重且逐年增加，耐药率在全球部分地区甚至高达50％，给近平滑念珠菌感染的预防和治疗构成了严峻挑战。

2、念珠菌对唑类药物的耐药最常见途径是麦角甾醇生物合成机制的改变，主要为药物靶点14-α-去甲基化酶erg11或后期合成关键酶erg3突变或过度表达。药物外排泵包括atp转运蛋白家族(cdr1和cdr2)和蛋白外排超家族(mdr1)表达上调是念珠菌产生对唑类药物的耐药性的另一关键因素，多由其对应的转录因子tac1和mrr1发生功能获得性突变所介导。但是目前针对近平滑念珠菌的唑类耐药机制研究尚缺乏。虽然已有研究表明存在一些突变与耐药获得潜在相关，但其功能仍待验证。

3、临床上对微生物耐药的检测有以表型或基因型为鉴定对象的两类检测方法，目前临床常规检测方法主要为传统表型检测方法，包括纸片扩散法、浓度梯度稀释法和肉汤稀释法，但耗时均较长。快速表型药敏检测通过检测抗菌药物存在下病原菌的生长阻滞情况，来判断其耐药性或检测药物敏感性。但这类方法操作耗时、所需设备昂贵、存在放射性危害，且较难实现快速高效的筛查。基因型耐药性检测方法是直接从临床样本中检测与耐药性相关的基因的有无、表达量或者突变情况，从而判定是否耐药，对生长缓慢(如真菌)或难培养的病原体具有重要价值。相对于其他方法，该类方法检测时间短、能定量分析，并可明确对应耐药机制。基因型检测耐药型方法需要依托于对微生物耐药机制的挖掘与研究，需敏锐发现新耐药机制以降低假阴性。

技术实现思路

1、为了进一步挖掘和明确导致近平滑念珠菌对唑类药物产生耐药性的基因突变位点，本技术对近平滑念珠菌耐药分离株做了进一步探究和分析，分别在近平滑念珠菌mrr1基因和近平滑念珠菌tac1基因上发现了新的突变位点，并明确了其耐药功能。本技术提供近平滑念珠菌唑类耐药相关的新突变位点及其应用。

2、第一方面，本技术提供一种近平滑念珠菌唑类耐药相关mrr1基因的新突变位点。

3、所述突变位于mrr1基因在如seq id no 1所示的碱基序列的第1873位，发生的点突变为碱基c替换为碱基a(c1873a)；对应地，编码的mrr1蛋白在如seq id no 15所示的氨基酸序列上的第625位氨基酸由谷氨酰胺变为赖氨酸(q625k)。

4、突变后的mrr1基因(c1873a)编码的mrr1蛋白的氨基酸序列如seq id no 16所示。

5、第二方面，本技术提供一种近平滑念珠菌唑类耐药相关tac1基因的新突变位点，采用如下的技术方案：

6、所述突变位于tac1基因在seq id no 2所示的碱基序列第1318位，发生的点突变为碱基g突变为t(g1318t)，对应地，编码的tac1蛋白在seq id no 17所示的氨基酸序列的第440位氨基酸由天冬氨酸替换为酪氨酸(d440y)；和/或，所述突变位于tac1基因的第1475位，发生的点突变为碱基c突变为碱基t(c1475t)，对应地，编码的tac1蛋白在如seq id no17所示的氨基酸序列上的第440位氨基酸由苏氨酸替换为蛋氨酸(t492m)。

7、突变后的tac1基因(g1318t)编码的tac1蛋白的氨基酸序列如seq id no 18所示。

8、突变后的tac1基因(t492m)编码的tac1蛋白的氨基酸序列如seq id no 19所示。

9、第三方面，本技术提供一种检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的试剂盒，采用如下的技术方案：

10、一种检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测上述mrr1基因的第1873位点和/或上述tac1基因的第1318位点和/或第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针。

11、优选地，所述用于检测上述mrr1基因的第1873位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 3所示的碱基序列。

12、优选地，所述用于检测上述tac1基因的第1318位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 4所示的碱基序列。

13、优选地，所述用于检测上述tac1基因的第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 5所示的碱基序列。

14、第四方面，本技术提供一种检测近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变位点的微流控芯片，采用如下的技术方案：

15、一种检测近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变位点的微流控芯片，所述试剂盒包括用于检测上述mrr1基因的第1873位点和/或上述所述的tac1基因的第1318位点和/或第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针。

16、优选地，所述用于检测上述mrr1基因的第1873位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 3所示的碱基序列。

17、优选地，所述用于检测上述tac1基因的第1318位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 4所示的碱基序列。

18、优选地，所述用于检测上述tac1基因的第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 5所示的碱基序列。

19、第五方面，本技术提供一种上述近平滑念珠菌唑类耐药相关mrr1基因的新突变位点、权利要求2所述的近平滑念珠菌唑类耐药相关tac1基因的新突变位点、权利要求3所述的检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的试剂盒或权利要求4所述的检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的微流控芯片在快速检测近平滑念珠菌耐药性中的应用，所述应用为非疾病诊断或治疗领域中的应用。

20、优选地，所述耐药性为针对唑类药物的耐药性：所述mrr1基因的c1873a突变(氨基酸突变为q265k)导致菌株对氟康唑耐药；所述tac1基因的g1318t突变(氨基酸突变为d440y)和c1475t突变(氨基酸突变为t492m)均可导致菌株对氟康唑、泊沙康唑和伊曲康唑耐药。

21、第六方面，本技术提供一种近平滑念珠菌唑类耐药性的快速筛查法，采用如下的技术方案：

22、一种近平滑念珠菌耐药性的快速筛查法，利用微流控芯片技术快速检测近平滑念珠菌mrr1基因第1873位点和/或近平滑念珠菌tac1基因第1318位点和/或近平滑念珠菌tac1基因第1475位点的碱基类型；所述快速筛查法用于非疾病诊断领域。

23、优选地，所述利用微流控芯片技术进行快速检测的方法为arms-qpcr。

24、第七方面，本技术提供一种引物序列组合，采用如下的技术方案：

25、一种引物序列组合，所述引物序列组合包括用于检测上述近平滑念珠菌mrr1基因第1873位点碱基为突变型或野生型的引物序列；和/或，用于检测上述近平滑念珠菌tac1基因第1318位点碱基为突变型或野生型的引物序列；和/或，用于检测上述近平滑念珠菌tac1基因第1475位点碱基为突变型或野生型的引物序列；

26、优选地，所述用于检测近平滑念珠菌mrr1基因第1873位点的引物序列包括：

27、m-f-1——包括如seq id no 6所示的碱基序列；

28、m-f-2——包括如seq id no 7所示的碱基序列；

29、m-r-2——包括如seq id no 8所示的碱基序列。

30、其中，所述m-f-1与所述m-r-2合用，用于检测野生型位点；所述m-f-2与所述m-r-2合用，用于检测突变型位点。

31、优选地，所述用于检测近平滑念珠菌tac1基因第1318位点的引物序列包括：

32、t1-f-1——包括如seq id no 9所示的碱基序列；

33、t1-f-3——包括如seq id no 10所示的碱基序列；

34、t1-r-3——包括如seq id no 11所示的碱基序列。

35、其中，所述t1-f-1与所述t1-r-3合用，用于检测野生型位点；所述t1-f-3与所述t1-r-3合用，用于检测突变型位点。

36、优选地，所述用于检测近平滑念珠菌tac1基因第1475位点的引物序列包括：

37、t2-f-1——包括如seq id no 12所示的碱基序列；

38、t2-f-4——包括如seq id no 13所示的碱基序列；

39、t2-r-3——包括如seq id no 14所示的碱基序列。

40、其中，所述t2-f-1与所述t2-r-3合用，用于检测野生型位点；所述t2-f-4与所述t2-r-3合用，用于检测突变型位点。

41、综上所述，本技术具有以下有益效果：

42、本技术发现的近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变位点提高了近平滑念珠菌耐药性的分子检测水平，能够有效缩短阳性检出患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。