一种赤潮中肋骨条藻的无菌处理方法

本发明涉及海洋微藻，具体为一种赤潮中肋骨条藻的无菌处理方法。

背景技术：

1、中肋骨条藻(scientific name:skeletonema costatum)隶属硅藻门、中心硅藻纲、圆筛藻目、骨条藻科。温带、热带海洋硅藻类，从北极到赤道、从外海高盐度到沿海低盐度水团均有分布，我国各海区均有出现。藻体为单个细胞。细胞体透镜形或圆柱形，壳面圆而鼓起，着生一圈细长的刺，与相临细胞的对应刺组成长链。

2、由于中肋骨条藻具有广温广盐的生长特性以及较快的繁殖能力，在藻华爆发时经常能够在竞争中占据优势生态位，从而成为藻华爆发的优势藻株之一。在爆发过程中海水颜色呈黄绿色或墨绿色并伴有明显的腥味，而且过量增殖的中肋骨条藻不仅会严重污染当地海洋环境，而且影响海洋生物及近海养殖。

3、海洋环境中，中肋骨条藻能够利用co2和hco3-作为无机碳源，其大量繁殖时会引起海水co2浓度下降，海水ph显著升高，使海洋无机碳存在形式发生改变，低浓度的co2环境限制其它浮游植物以co2和hco3-为碳源进行光合作用，进而抑制它们的生长，从而严重破坏生态环境。

4、同时，中肋骨条藻的过度爆发，也会堵塞鱼类的呼吸器官，导致多数鱼类因鱼鳃损害而死亡，对沿海渔业造成了数以亿计的经济损失。

5、在经济海藻养殖区，中肋骨条藻也常与经济藻类海带、紫菜等争夺营养，在营养丰富环境下，中肋骨条藻快速繁殖，从而导致赤潮爆发，其大量水华造成经济藻类变色，甚至腐烂而失去食用和商业价值。

6、微生物作为藻华防治新方向，在不改变原有生态结构的基础上，延缓赤潮藻的生长速度，甚至可以在初期就能预防藻华的进一步爆发。微生物对于藻体的影响有两种，直接破坏藻体结构或产生除藻活性物质来抑制或者破坏细胞结构来杀死藻细胞。无菌处理后的藻液能够更好的的筛选出抑藻微生物及研究相应机理，为后续赤潮处理提供依据。

7、中肋骨条藻在文献中研究关键词菌藻共生也有较高的研究。菌藻共生已被实际应用于去除废水中的营养盐及重金属。研究发现，藻菌共生系统中的藻类能够明显去除富营养化水体中的氮、磷和有机物，降低生物需氧量和化学需氧量等。当营养物质被消耗后，缺乏营养物质的中肋骨条藻也会消亡，不会污染环境。而菌藻共生研究需要藻体在无菌环境下，从而排除其他微生物造成的影响。

8、对中肋骨条藻进行无菌处理的主要目的是尽可能的消除中肋骨条藻藻液中的微生物，使中肋骨条藻藻液达到相对无菌的状态。无菌处理可以确保中肋骨条藻的纯净性，避免中肋骨条藻藻液中其他微生物对研究造成的影响，保证实验结果的可靠性和准确性，也有利于研究单种或多种细菌对于中肋骨条藻的影响，从而发现抑藻细菌，进而作为赤潮爆发的防治手段。

9、现有的方法主要是：

10、1、通过单种抗生素对藻体进行无菌处理，主要通过五种抗生素对中肋骨条藻进行处理，如下：青霉素(amipicillin)、硫酸庆大霉素(gentamycin sulfate)、硫酸新霉素(nomycin sulfate)、氯霉素(chcoramphencol)、硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)。该方法的缺点是需要抗生素浓度较高，对于环境影响较大，同时高浓度的抗生素会对藻体也会造成一定的损伤。而在低浓度条件下处理，无菌处理效果不理想。

11、2、通过双抗生素多粘菌素b和硫酸链霉素共同处理时，能够有效的抑制细菌。缺点是多粘菌素b价格较高，不利于推广。

12、3、确定经过处理的藻液是否达到相对无菌，通常是仅通过平板菌落计数法来确定。缺点为不能确定是否由于实验操作问题，例如涂布棒过热导致细菌死亡，从而菌落不生长；为此提供了一种中肋骨条藻的无菌处理方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种中肋骨条藻的无菌处理方法，以解决背景技术中的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种中肋骨条藻的无菌处理方法，具体步骤如下：

3、s1：配置母液；称取氨苄青霉素、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素，添加121℃灭菌的无菌水混匀溶解，获得三种抗生素溶液；将所得抗生素溶液在超净台使用过滤头进行过滤；

4、s2：制备待除菌的中肋骨条藻培养液，并在培养过程中使用121℃灭菌并添加f/2培养基处理的海水进行培养，将抗生素添加至藻液中全程使用超净台进行操作；

5、s3：将经过过滤后的抗生素溶液加入至待除菌的中肋骨条藻培养液中，在培养液中，然后进行一段时间的无菌化培养；

6、s4：在中肋骨条藻藻液达到相对无菌后，定期进行中肋骨条藻培养液的扩培，扩培时追加同等终浓度的抗生素溶液；

7、s5：在中肋骨条藻藻液达到相对无菌后，定期进行中肋骨条藻培养液的扩培，扩培时使用的海水为添加f/2培养基的121℃灭菌海水；

8、s6：每7天进行一次藻培养液的扩培，防止藻体在培养过程中达到衰亡期，使大多数藻体细胞保持在较高的活性下，并取不再继续添加抗生素的中肋骨条藻培养物培养7天，观察加入2216e培养液的藻液是否导致2216e培养液产生浑浊，取1ml藻培养液进行2216e琼脂培养基平板涂板，观察培养皿菌落的生长情况；

9、s7：每次添加灭菌海水时，都需取样观察，若溶液变浑浊或平板出现菌落则需再次添加抗生素进行处理。

10、作为本发明的一种优选技术方案，所述s1中过滤时，通过0.22μm的过滤头于超净台进行过滤，并分装于玻璃瓶中备用，并贴好标签，标签上注明浓液的名称、配置时间、浓度。

11、作为本发明的一种优选技术方案，所述s1中的抗生素溶液通过配置母液，并通过计算进行稀释，获得所需的浓度，配置的母液浓度如下：氨苄青霉素溶液的母液浓度为50mg/ml，硫酸链霉素、硫酸卡那霉素的母液浓度为10mg/ml。

12、作为本发明的一种优选技术方案，所述s2中待除菌的中肋骨条藻培养液的制备方法为：取中肋骨条藻培养液原液，使用计数板进行藻细胞计数，确定原液藻细胞浓度，以1000cells/ml的接种量为起始浓度进行藻种扩充培养，得到待除菌的中肋骨条藻培养液。

13、作为本发明的一种优选技术方案，所述s3中进行无菌处理的抗生素溶液溶度如下：氨苄青霉素、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素的终浓度均为20μg/ml。

14、本发明的有益效果是：本发明采用氨苄青霉素、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素等较为常见的抗生素对中肋骨条藻进行无菌处理，不但能够有效地排除微藻培养液内的细菌，而且使用三种抗生素后藻体的健康状况没有发生较大改变，能够保持藻体的活力，有利于开展后续相关，获得较为可靠的实验结果，为研究其中肋骨条藻赤潮形成机制及菌藻共生奠定基础。

15、1.本发明采用抗生素处理结合平板菌落计数法及培养液观测法获得相对无菌的藻体培养液，培养液能够对所做实验是否达到无菌进行补充，证实实验达到无菌化；

16、2.在本发明中，中肋骨条藻的无菌处理方法步骤简单，易于操作；

17、3.在无菌处理中，设置适宜的浓度以及定期的扩充培养，持续抗菌效果好，同时成本低，环保性高；

18、4.从经济节约和环保角度考虑，适合选用低终浓度的抗生素进行无菌处理，并使用121℃灭菌的海水进行扩培，使藻培养物维持在一个相对无菌的状态，以满足基本实验要求。