一种抗菌多肽、多肽衍生物及其制备方法与应用

本技术属于生物医药领域，具体涉及一种抗菌多肽、多肽衍生物及其制备方法与应用。

背景技术：

1、抗生素一直被用来治疗各种病原体感染性疾病，但随着抗生素的滥用，越来越多的耐药菌产生，寻找替代抗生素的新型抗菌药物也迫在眉睫。抗菌多肽因其不易产生耐药的独特抑菌机制而备受关注。抗菌多肽是机体先天性免疫系统的重要组成部分，它也是广泛存在于自然界生物体中的小分量肽类物质。因其对病毒、耐药性细菌、真菌、寄生虫、癌症细菌等都具有广泛的抑制作用，也导致了其在医药行业以及食品添加剂等领域中具有良好的潜在应用前景。此外，多肽类药物具备低免疫原性、靶向特异性修饰和低分子量的特点，成为近年来新型抗菌和抗肿瘤药物研发的重点。

2、抗菌多肽大多数是两亲性阳离子多肽，其所带的正电荷与带负电荷的细菌细胞膜通过静电相互作用，使得抗菌多肽吸附积聚在细菌细胞膜外表面，达到一定浓度后，便对细菌细胞膜产生影响，从而达到抑菌作用。研究表明抗菌多肽可通过上述的膜溶性机制抑菌细菌生长，也可以通过与细胞内靶点(如dna、rna和蛋白质)相互作用的非膜溶机制导致细菌死亡。

技术实现思路

1、1.发明目的

2、本技术的发明目的是提供一种抗菌多肽、多肽衍生物及其制备方法与应用，该抗菌多肽为两亲性阳离子抗菌多肽，能够高效抑制耐药性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，而其衍生物能进一步提高抗菌效果，具有良好的应用前景。

3、2.技术方案

4、为了实现上述目的，本技术所采用的技术方案如下：

5、本技术提供了一种抗菌多肽，该多肽的氨基酸序列为：grllkrllkrllkl(seq idno.1)。

6、本技术还提供了上述一种抗菌多肽的衍生物，该多肽衍生物是上述抗菌多肽氨基酸侧链基团上或氨基端或羧基端进行修饰得到的产物。

7、进一步地，上述修饰包括氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇peg修饰或固定化修饰。

8、进一步地，上述修饰为羧基端酰胺化，其序列为：grllkrllkrllkl-nh2。

9、本技术还提供了上述一种抗菌多肽的制备方法，该制备方法是以dmf为溶剂、dcm为膨胀剂、dic为催化剂的固相合成方法，具体包括如下步骤：

10、s1，将rink amide mbha树脂进行脱保护后，与fmoc-leu(otbu)-oh(芴甲氧羰基-亮氨酸-4-叔丁脂)浸泡于dcm(二氯甲烷)中，抽干后加入dmf(二甲基甲酰胺)溶剂，接着加入dic(n,n-二异丙基碳二亚胺)、hobt(1-羟基苯并三氮唑)进行接触反应，然后进行洗涤；

11、s2，将dmf、乙酸酐和diea(n,n-二异丙基乙胺)加入反应体系中进行封头处理，洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为无色；接着加入哌啶进行脱保护，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

12、s3，将fmoc-lys(otbu)-oh(芴甲氧羰基-赖氨酸-4-叔丁脂)、hobt(1-羟基苯并三氮唑)、dic(n,n-二异丙基碳二亚胺)加入反应体系中进行接触反应，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为无色；接着加入哌啶进行脱保护，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

13、s4，重复s3步骤，按照氨基酸序列依次将fmoc-leu(otbu)-oh(芴甲氧羰基-亮氨酸-4-叔丁脂)、fmoc-arg(otbu)-oh(芴甲氧羰基-精氨酸-4-叔丁脂)、fmoc-lys(otbu)-oh(芴甲氧羰基-赖氨酸-4-叔丁脂)、fmoc-gly(otbu)-oh(芴甲氧羰基-甘氨酸-4-叔丁脂)加入反应体系中进行接触反应，待氨基酸序列全部接上之后，接着加入哌啶，进行脱保护、洗涤、检测为蓝色；

14、s5，依次通过dmf、甲醇洗涤，然后干燥、加入切割液b切割、沉降、纯化，得到两亲性阳离子抗菌多肽grllkrllkrllkl。

15、本技术还提供了上述一种多肽衍生物的制备方法，该制备方法是以dmf为溶剂、dcm为膨胀剂、dic为催化剂的固相合成方法，具体包括如下步骤：

16、s1，将rink amide mbha树脂进行脱保护后，与fmoc-leu(otbu)-oh(芴甲氧羰基-亮氨酸-4-叔丁脂)浸泡于dcm(二氯甲烷)中，抽干后加入dmf(二甲基甲酰胺)溶剂，接着加入dic(n,n-二异丙基碳二亚胺)、hobt(1-羟基苯并三氮唑)进行接触反应，然后进行洗涤；

17、s2，将dmf、乙酸酐和diea(n,n-二异丙基乙胺)加入反应体系中进行封头处理，洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为无色；接着加入哌啶进行脱保护，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

18、s3，将fmoc-lys(otbu)-oh(芴甲氧羰基-赖氨酸-4-叔丁脂)、hobt(1-羟基苯并三氮唑)、dic(n,n-二异丙基碳二亚胺)加入反应体系中进行接触反应，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为无色；接着加入哌啶进行脱保护，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

19、s4，重复s3步骤，按照氨基酸序列依次将fmoc-leu(otbu)-oh(芴甲氧羰基-亮氨酸-4-叔丁脂)、fmoc-arg(otbu)-oh(芴甲氧羰基-精氨酸-4-叔丁脂)、fmoc-lys(otbu)-oh(芴甲氧羰基-赖氨酸-4-叔丁脂)、fmoc-gly(otbu)-oh(芴甲氧羰基-甘氨酸-4-叔丁脂)加入反应体系中进行接触反应，待氨基酸序列全部接上之后，接着加入哌啶，进行脱保护、洗涤、检测为蓝色；

20、s5，依次通过dmf、甲醇洗涤，然后干燥、加入切割液b切割、沉降、纯化，得到两亲性阳离子抗菌多肽衍生物grllkrllkrllkl-nh2。

21、进一步地，上述s1中，浸泡的条件为：浸泡温度为20～25℃，浸泡时间为2～5min。

22、进一步地，上述s1中，接触反应的条件为：反应温度为20～25℃，反应时间为4～10h。

23、进一步地，上述s1中，相对于1g的树脂，当取代度为0.5时，dcm的用量是20～30ml；fmoc-leu(otbu)-oh的用量为0.25～0.3g；dmf的用量为20～30ml，dic的用量为1～2ml；hobt的用量为0.2～0.25g。

24、进一步地，上述s2中，相对于1g的树脂，dmf的用量为20～30ml；diea的用量为2～3ml；乙酸酐的用量为2～3ml。

25、进一步地，上述s2中，封头处理的条件为：处理温度为20～25℃，处理时间为30～60min。

26、进一步地，上述s2中，脱保护的条件为：温度为20～25℃，时间为15～30min。

27、进一步地，上述s3中，相对于1g的树脂，fmoc-lys(otbu)-oh的用量为0.70～0.75g；hobt的用量为0.2～0.3g；dic的用量为0.5～0.6ml。

28、进一步地，上述s3中，接触反应的条件为：反应温度为20～25℃，反应时间为1h。

29、进一步地，上述s4中，相对于1g的树脂，fmoc-leu(otbu)-oh(芴甲氧羰基-亮氨酸-4-叔丁脂)的用量为0.5～0.6g，fmoc-arg(otbu)-oh(芴甲氧羰基-精氨酸-4-叔丁脂)的用量为0.9～1.0g，fmoc-lys(otbu)-oh(芴甲氧羰基-赖氨酸-4-叔丁脂)的用量为0.7～0.75g，fmoc-gly(otbu)-oh(芴甲氧羰基-甘氨酸-4-叔丁脂)的用量为0.4～0.5g。

30、进一步地，上述s4中，接触反应的条件为：反应温度为20～25℃，反应时间为45～60min。

31、进一步地，上述s4中，脱保护的条件为：温度为20～25℃，时间为15～30min。

32、进一步地，上述s5中，相对于1g的树脂，dmf、甲醇的用量均为15～20ml。

33、进一步地，上述s5中，切割液b由tfa(三氟乙酸)、水、edt(乙二硫醇)和tmsbr(甲基硅烷)组成。更进一步地，切割液b中tfa(三氟乙酸)：水：edt(乙二硫醇)：tmsbr(甲基硅烷)的体积比为95：2：2：1。

34、进一步地，上述s5中，切割的条件为：切割温度为20～25℃，切割时间为2～2.5h。

35、本技术还提供了上述一种抗菌多肽或多肽衍生物在抑制细菌中的应用。

36、进一步地，上述细菌包括耐药性大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌。

37、本技术还提供了上述一种抗菌多肽或多肽衍生物在治疗细菌感染中的应用。

38、本技术还提供了上述一种抗菌多肽或多肽衍生物、和/或其制备方法在制备治疗细菌感染的药物中的应用。

39、本技术还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括上述抗菌多肽或多肽衍生物。

40、进一步地，上述药物组合物含有一种或者是多种药学上可以接受的载体。

41、进一步地，上述药学上可以接受的载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

42、3.有益效果

43、本技术与现有技术相比，其有益效果在于：

44、(1)本技术提供的一种抗菌多肽，为两亲性阳离子抗菌多肽，能够高效抑制耐药性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。进一步地，本技术对该抗菌多肽进行修饰，具体为羧基端酰胺化，修饰后得到的多肽衍生物具有更好的抑菌效果，具有良好的应用前景。

45、(2)本技术提供的抗菌多肽或多肽衍生物的制备方法，制备方法简单易行，能够高效合成抗菌多肽或多肽衍生物。