一种靶向CD137的探针及其应用

本发明涉及医学检测，尤其涉及一种靶向cd137的探针及其应用。

背景技术：

1、cd137(又称4-1bb)是肿瘤坏死因子受体家族的一种表面糖蛋白，可诱导多种免疫细胞和非免疫细胞，包括内皮细胞和平滑肌细胞。人cd137是一种存在于细胞膜表面的ii型膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体tnfr超家族成员，它不仅表达于活化的t淋巴细胞，亦可表达于单核细胞、粒细胞及树突状细胞(dc)等细胞上。cd137不仅在免疫细胞中表达，也在血管细胞中表达，主要由活化内皮细胞(ecs)和平滑肌细胞(smcs)表达。cd137/cd137l是cd28/b7之外的另一重要的共刺激分子，可依赖或不依赖于cd28/b7途径而介导共刺激分子cd137与cd137l相互作用产生的协同刺激信号，在细胞间相互作用、细胞粘附、抗原递呈、t细胞共刺激以及信号传导中起不同的作用。cd137及其配体系统存在双向信号传导，既可以通过cd137受体向t细胞传导信号，又可将信号传向表达配体的细胞。cd137阳性血管已在动脉粥样硬化病变、肿瘤和血管炎中被发现。被认为是炎症反应的主要参与者和调节剂。激活cd137信号诱导的内皮功能障碍有效地诱导了炎症状态，这在多种病理状况中起着关键作用。

2、1、cd137与动脉粥样硬化

3、动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是动脉壁的慢性炎性病变，可以长期隐匿存在，直到斑块破裂和血栓形成，进而可导致急性冠状动脉综合征和猝死。血管内皮功能障碍和形态学损伤导致白细胞粘附、血管收缩、血小板聚集、氧化应激、平滑肌增殖和血栓形成会促进内皮细胞损伤形成并诱导内皮细胞凋亡，导致局部内皮脱落，导致斑块侵蚀形成，导致急性冠脉综合征的发生。因此，内皮功能障碍通过多种途径参与动脉硬化。斑块内持续炎症与斑块的不稳定和破裂有关，因此检测斑块是否存在进行性炎症反应，有助于as早期诊断和风险评估。在小鼠和人体内动脉粥样硬化斑块病变的动脉粥样硬化相关血管细胞中，cd137的表达普遍上调。在体外促炎环境刺激下，发现高脂饲喂敲低cd137的apoe小鼠的主动脉粥样硬化区域显著减少，这表明cd137促进动脉粥样硬化。因此，cd137可作为研究as进展的有效标志物。olofsson ps等人证实cd137是表达于高风险斑块活化的血管内皮细胞、斑块内活化的t细胞和单核细胞膜表面的共刺激分子，具有高特异性，当配体与其结合时促进斑块内白细胞进一步活化和增多、致炎因子分泌，有潜力作为高风险斑块示踪和治疗的靶点。如何有效利用影像方法监测as发生发展已成为迫在眉睫的问题。

4、鉴于传统的临床策略受到的限制，迫切需要以一种更有效、无创的方法对动脉粥样硬化进行早期干预。而如何根据易损斑块的特征进行早期诊断及有效干预治疗，减少心血管病死亡率，成为当前亟待解决的问题。分子影像及纳米医学技术的迅猛发展正好能弥补这一短板，该成像方法能在分子和细胞水平对动脉粥样硬化斑块进行活体定性和定量研究,检测出坏死核心、炎症、斑块内出血、纤维帽厚度和微钙化等,实现as的早期检测和监控疾病的发生发展。基于合理设计并成功开发的靶向cd137的纳米分子探针将会给as等心血管疾病的早期诊断、预防和治疗带来新的希望。

5、2、cd137与肿瘤免疫治疗

6、近年来，以pd-1为代表的免疫疗法的出现已经彻底改变了癌症的治疗模式。cd137是肿瘤坏死因子受体超家族的一员，也是增强抗肿瘤免疫反应的一个有希望的靶点。cd137在免疫应答、肿瘤免疫中起重要作用，在多种肿瘤中呈高表达。cd137有助于调节许多免疫细胞的激活，包括cd4+t细胞、cd8+t细胞、调节性t细胞(treg)、树突状细胞和自然杀伤细胞。在胃癌中，癌细胞的免疫状态与cd137/cd137l的表达状态有关，如果肿瘤细胞cd137l呈高表达，则机体对于肿瘤细胞的杀伤作用会更强，反之，如果cd137l呈低表达，则会导致肿瘤的免疫逃逸。在大肠癌患者血清中也发现cd137显著增高，后续elisa法证实cd137在大肠癌的诊断中特异度为97％，敏感度为83％，有望成为新的早期大肠癌诊断标志物。

7、最近的研究表明靶向cd137的激动抗体可以增强免疫治疗的效果。cd137作为人单核/巨噬细胞的阳性免疫检查点在多个免疫细胞亚群中提供共刺激信号，因此通过cd137抗体与治疗性抗体共同刺激活化的t细胞、自然杀伤细胞细胞和其他免疫细胞已经成为一种很有前景的癌症免疫治疗方法。多种靶向cd137的药物也正在研发和临床试验中，未来将在肿瘤治疗中发挥重要的作用。然而，如何对敏感人群进行准确筛查和实时动态疗效监测是开展基于cd137精确治疗的前提条件。探索一种可以准确预测患者免疫治疗疗效的方法也是迫切需要解决的难题。目前最常用的预测方法是免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)，然而ihc检查存在根本的局限性：肿瘤异质性空间表达的特点导致其对标志物的检测不敏感，以及肿瘤取样不完全等因素可能导致检测出现假阳性或假阴性的结果。相比较而言，分子影像(molecular imaging)在免疫治疗和个性化医学中发挥越来越重要的作用。其中分子探针的制备是分子影像的关键，高灵敏度和特异性的分子探针进入体内后可与细胞内特定的靶点发生特异性结合并产生特异性信号，体外通过特定的影像设备进行信号捕捉，例如通过正电子发射计算机断层扫描(pet-ct)、单光子发射计算机断层成像术(spect)、磁共振成像(mri)以及荧光成像(fl)等进行采集成像，从而达到特异性诊断，实现高度特异性的诊断。

8、当前已报道的免疫检查点诊疗试剂主要以抗体为主，而抗体诊断试剂面临的问题有：体内半衰期过长、血液清除速度慢、多种靶标同时存在但抗体同时识别难度大、难于化学修饰和穿透能力差等。而多肽类靶向小分子药物及诊断探针以成本低、分子量小、生物相容性好、穿透性强、无免疫原性、并有较快的血液清除速率、制备简单等特点，在肿瘤靶向给药、癌症诊断等方面表现出很强的优越性。

技术实现思路

1、随着肿瘤免疫治疗的广泛应用，需要通过开发非侵入性分子影像工具实现对临床免疫检查点和免疫细胞的动态监测来评估疗效和筛选合适的病人。因此，需要开发一种针对cd137靶标的小分子探针，以实现快捷、简便、动态准确识别肿瘤组织中t细胞表面cd137蛋白表达水平，看是否有效激活免疫细胞，这对于免疫治疗及预后评估有着重要的临床意义。

2、在动脉粥样硬化斑块病变的相关血管细胞中cd137的表达普遍上调，具有高特异性，可作为高风险斑块示踪和治疗的靶点，用于as的早期检测和监控疾病的发生发展。

3、本发明提供一种靶向cd137的探针及其应用，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供一种cd137靶向多肽，所述cd137靶向多肽包括seq id no.1-3任一所示的氨基酸序列。

4、本发明根据cd137/cd137l相互作用的这些热点氨基酸位点和分子识别理论进行肽库的设计和构建。采用氨基修饰的tentagel树脂作为固相载体，利用fmoc合成策略进行混合均分合成库容量为105的一珠一物肽库。利用荧光标记磁球和微流控芯片的方法进行高通量一珠一物肽库筛选，阳性肽珠经maldi-tof-ms鉴定，获得了一系列能特异性结合cd137的活性多肽。其中，wp1-3具备cd137亲和力。

5、seq id no.1：rkeefyywlwfc(wp1)；

6、seq id no.2：svstyldasnrac(wp2)；

7、seq id no.3：acieegqycpadpymca(wp3)。

8、本发明进一步提供所述cd137靶向多肽的制备方法，包括：

9、通过fmoc固相肽合成方法合成所述cd137靶向多肽。

10、第二方面，本发明提供一种核酸，所述核酸用于编码如seq id no.1-3所述的cd137靶向多肽。

11、第三方面，本发明提供一种多价体，所述多价体包括至少2条多肽；所述多肽选自seq id no.1-3所述的cd137靶向多肽。所述多价体中以线性、d型化、环化或镜像结构形成。

12、本发明提供的多价体中，不同多肽间通过共价连接、非共价连接或多聚体混合的形式连接；

13、优选地，所述共价连接为通过连接分子进行连接，所述连接分子包括6-叔丁氧羰肼基烟酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺或n-羟基琥珀酰亚胺中的一种或多种；和/或，

14、所述多聚体包括聚乙二醇、聚乙烯醇、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子、聚乳酸或聚乳酸-乙醇胺中的一种或多种。

15、第四方面，本发明提供一种分子探针，所述分子探针由荧光标记和/或放射性同位素标记如下任一得到：

16、i)如上述cd137靶向多肽，

17、ii)如上述多价体。

18、本发明提供的分子探针中，所述荧光标记为irdye800cw、cy7、罗丹明或吲哚菁绿中的一种或多种，所述放射性同位素为131i、177lu、64cu、99mtc、18f或68ga中的一种或多种；

19、优选地，所述荧光标记和所述放射性同位素通过螯合剂dota、nota、dtpa、hynic对所述cd137靶向多肽或多价体进行标记；也可通过nhs、edc、mal等点击化学方式进行标记；

20、更优选地，所述分子探针还包括氧化铁纳米颗粒fe3o4。

21、本发明进一步提供所述cd137靶向多肽，或所述多价体，或所述分子探针在和cd137特异性结合中的应用。

22、第五方面，本发明还提供了上述的cd137靶向多肽，或上述核酸，或上述多价体，或上述分子探针在制备疾病检测试剂盒中的应用。

23、以及上述的cd137靶向多肽，或上述核酸，或上述多价体，或上述分子探针在制备药物中的应用；

24、优选地，所述药物用于cd137阳性血管内皮细胞、t细胞和单核细胞相关疾病的预防、诊断或治疗；

25、优选地，所述药物还包括显像制剂和能杀伤癌细胞的制剂；所述显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物、氧化铁磁共振造影剂或分子影像制剂中的一种或多种。进一步地，所述分子探针或所述多价体与所述显像制剂相缀合或混合。

26、进一步优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体。例如plga聚合物、dendrimer树状大分子、水凝胶、胶束、脂质体或无机纳米颗粒。

27、在本发明所提供的上述应用中，所述疾病包括肿瘤、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、冠心病中的任意一种。所述肿瘤为多发性骨髓瘤、肿瘤为脑胶质瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌和/或乳腺癌。

28、在本发明所提供的应用中，所述药物用于cd137阳性的动脉粥样硬化斑块和肿瘤的预防、诊断或治疗。

29、第六方面，本发明提供一种药物或疾病检测试剂盒，所述药物包括上述cd137靶向多肽，或上述核酸，或上述多价体，或上述分子探针。

30、本发明的有益效果至少为：

31、(1)本发明发现了一种具有靶向cd137阳性t细胞或血管内皮细胞的特性的多肽，其可以作为分子探针用于监测接受免疫治疗的病人，同时进行疗效评估；还可以作为靶向多肽，与免疫制剂相缀合或混合，用于多种肿瘤的靶向治疗和成像；还可以优化该多肽将其本身作为多肽药物，激活cd137-cd137l信号通路，激活t细胞促进免疫治疗。

32、(2)本发明进一步基于发现的cd137靶向多肽提供了一种分子探针，其可以在保持良好靶向性的基础上，克服基于单抗的分子探针的分子量大、易失活、组织渗透慢、血液清除慢等缺陷。本发明提供的分子探针可以用于临床常用的pet检测，有利于后期临床转化，可以全面显示肿瘤区域内t细胞上cd137表达水平，同时在整个治疗过程中监测cd137水平的动态变化，具有较好的研究前景和临床指导意义。

33、(3)本发明提供的分子探针的制备方法简单易行，成本低廉，实用性强，且具有良好生物安全性和较高的应用价值。