一种间充质干细胞治疗软骨损伤的方法与流程

本技术涉及生物治疗领域，具体的涉及一种间充质干细胞治疗软骨损伤的方法。

背景技术：

1、软骨缺损可由创伤、磨损、赘生物、先天性畸形等引起。创伤是导致关节软骨缺损的最常见原因。主要是由于运动或意外事故造成。损伤所产生的剪切力可导致关节软骨压迫性骨折或骨软骨分离。关节软骨属于透明软骨，受损后被周围组织形成的细胞和基质恢复和替代，但软骨组织的修复能力很差，它的组织学和生物学特性限制了它的修复能力，多不能恢复原有的结构和功能。成熟的软骨细胞受到损伤时的合成能力虽然增加，但很有限而不能满足修复的需要。

2、关节软骨损伤对人类健康带来极大危害，加重了社会医疗的负担。目前外科治疗方法主要有关节镜下关节腔冲洗、钻孔微骨折、软骨清理成形、自体或异体骨软骨移植。这些方法虽然各有不同，但对于缓解损伤所带来的疼痛症状、延缓关节退行性变和恢复一定关节功能具有重要作用。近年来随着科技的发展，干细胞治疗给软骨修复带来福音。

3、干细胞根据其来源可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类，es细胞具有无限增殖能力和分化全能性，目前已经在肌肉、血管内皮、神经等数种组织构建研究中获得初步成功。然而，关于es细胞向软骨细胞定向分化的研究还停留在起步阶段。而且，es细胞应用的免疫原性、致瘤性和伦理性等问题也限制了它进一步推广应用。相比之下，成体干细胞在体内分布广泛、增殖活力强、且具有多向分化潜能，而且定向诱导分化技术相对较为成熟，已经成为组织工程种子细胞研究的热点。间充质干细胞可以来源于于各种组织如骨髓，脂肪或脐血。这些细胞有能力在体外增殖和分化成一系列组织，包括成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，心肌细胞和血管细胞。由于这种能力，间充质干细胞为组织再生领域的研究和临床用途提供一个广阔的前景。

4、间充质干细胞(mscs)具有典型的干细胞特点，终身存在于骨髓和其他组织器官中，负责组织的修复和更新，而且具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下可以分化成许多不同的组织，如骨组织、软骨组织、脂肪组织、内皮组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织等。由于mscs的自我复制和多向分化的能力，近年来成为组织工程骨构建过程中最常用的种子细胞。骨髓mscs取材方便、创伤小且易于从骨髓中分离及体外扩增纯化，不像滑膜、脂肪等来源的mscs原代培养需要酶消化预处理。骨髓mscs虽仅占有核细胞数的0.001％-0.01％，但始终稳定保持分化成软骨细胞的能力，是终身可用的软骨前体细胞。骨髓mscs具有cd105细胞成软骨潜能似与cd105表达有关。与滑膜、脂肪等来源的mscs相比，骨髓mscs标志基因在平面培养时差异不明显，而在三维高密度培养时基因差别显著，有且只有骨髓mscs的软骨分化才能获得明显的改善，所以是用于软骨组织工程学研究较理想的种子细胞。通过对mscs细胞的分离和体外培养以及对培养条件的控制，可以促进mscs细胞分化成软骨细胞。而且骨髓间充质干细胞等可迁至软骨损伤处，生成修复性的纤维软骨组织。这种修复组织在生物力学性能、耐久性等方面虽不及健康软骨，但可覆盖、保护缺损区软骨下骨，减少软骨磨损和游离屑的形成。

5、相较于成熟软骨细胞或老龄骨骼肌细胞，间充质干细胞的高度增殖能力及软骨分化潜能更有利于软骨损伤修复。软骨表层微损伤方面，单能软骨细胞或关节腔细胞可为最优。临床上，研究者更倾向于将原代、未经处理过的骨髓间充质干细胞应用于i期骨折。实际上，关节微环境与多种因子包括生长因子、生物材料、蛋白酶及相邻软骨和软骨下骨整合细胞相关，上述因子均可参与关节重建治疗中。兔模型中，骨髓钻孔大小对骨折血块处成纤维克隆数量具有重要影响。实际上，4mm骨软骨关节裂口可释放300个细胞，由此推断，骨髓间充质干细胞在人骨关节炎修复中发挥重要作用。

6、此前在研究中发现，nos抑制剂具有抑制软骨细胞凋亡，进而治疗软骨损伤的疾病。但是目前，可用的nos抑制剂种类还不够多，有待于进一步的开发。此外，目前，采用干细胞治疗软骨损伤的方法还不够多，特别是联合使用其他药物来改善软骨损伤的治疗效果还有待进一步的研究和开发。

技术实现思路

1、本发明通过噬菌体库筛选特异性靶向并且抑制nos活性的多肽nos-s2，所述多肽序列如seq id no：2所示。

2、本发明所述的抑制nos活性的多肽nos-s2可以用于制备抑制nos活性的药物。

3、具体的，本发明提供了抑制nos活性的多肽nos-s2在制备用于治疗软骨损伤的药物中的用途。

4、为了增加疗效，进一步的，本发明还提供了抑制nos活性的多肽nos-s2和骨髓间充质干细胞的组合在制备用于治疗软骨损伤的药物组合物中的用途。

5、具体的，所述多肽的使用浓度为1-100mg/kg，优选的为1-50mg，更优选的为1-20mg/kg。

6、具体的，所述的干细胞的使用浓度为1-9×107/ml，优选的为1-5×107/ml，更优选的为1×107/ml。

7、具体的，所述的药物组合物在动物模型中的给药剂量是损伤处原位注射bmscs组注射bmscs细胞液(1×107/ml)0.5ml联合皮下注射nos-s2多肽10mg/kg。

8、更进一步的，本发明的药物组合物还含有其他试剂，所述其他试剂具有增益的治疗软骨损伤的效果。

9、进一步的，本发明的多肽还可以被保守性取代制备成为变体。多肽“变体”意指在比对序列和引入缺口(如果需要)以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的n端或c端添加、或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变体将具有至少约80％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将具有至少约90％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将与天然序列多肽具有至少约95％的氨基酸序列同一性。

10、进一步的，药物组合物还含有药学上可接受的载体。

11、“药学上可接受的载体”是指本领域常规的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、配制辅助剂或载体，其与共同包含用于施用于受试者的“药物组合物”的治疗剂一起使用。药学上可接受的载体在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与配制品的其他成分相容。药学上可接受的载体适用于所用配制品。

12、在某些实施方案中，药物组合物可以是固体剂型形式，优选胶囊或片剂。片剂、药丸、胶囊、药片和类似物可以含有下述的任何组分或者具有类似性质的化合物：粘合剂；稀释剂；分解剂；润滑剂；助滑剂；甜味剂；和调味剂。

13、粘合剂的例子包括微晶纤维素、黄芪胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶、植物粘胶、明胶溶液、蔗糖和淀粉糊。润滑剂包括滑石、淀粉、硬脂酸镁或硬脂酸钙、石松和硬脂酸。稀释剂包括例如乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露醇和磷酸氢钙。助滑剂包括但不限于胶状二氧化硅。分解剂包括交联羧甲纤维素钠、羧甲淀粉钠、海藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基纤维素。着色剂包括例如任何被批准的合法的可溶于水的fd和c染料、其混合物；和悬浮在水化氧化铝上的不溶于水的fd和c染料。甜味剂包括蔗糖、乳糖、甘露醇。

14、用于肠胃外药物组合物中的药学上可接受的载体包括含水媒介、无水媒介、抗微生物剂、等渗试剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、螯合剂或掩蔽剂和其他药学上可接受的物质。含水媒介的例子包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格注射液。无水肠胃外媒介包括植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、香油和花生油。其浓度可以达到抑制细菌或抑制真菌效果的抗微生物剂必须加入到包装于多剂量容器中的肠胃外制剂中，其中包括苯酚或甲酚、水银剂、苯甲醇、三氯丁醇、p-羟基苯甲酸甲酯和p-羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗试剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸利多卡因。悬浮和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯基吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80。金属离子的螯合剂或掩蔽剂包括edta。药物载体也包括用作可与水混溶的媒介的乙醇、聚乙二醇和丙二醇以及用于调节ph的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。

15、进一步的，本发明的药物组合物可设计注射剂以用于局部给药和全身性给药。通常，治疗上有效的剂量被配制，相对于接受治疗的组织，其含有浓度至少约0.1％w/w至高达约90％w/w，或更多的多肽，优选浓度大于1％w/w的活性多肽。应该理解的是，精确的剂量和治疗的持续时间与正在被治疗的组织有关，并且可以利用已知的测试方案经验性地确定，或由体内或体外测试数据推断得到。应该注意，浓度和剂量值也可以随着接受治疗的个体的年龄而变化。应该进一步理解的是，对于任何特定的患者，具体的给药方案应该依据个体的需要和正在执行或监督制剂给药的人员的专业判断而随着时间的推移进行调整，还应该理解的是，本文中阐述的浓度范围只是示范性的，并不是为了限制要求保护的制剂的范围或实施。

16、具体的，本文中提供的多肽或者骨髓间充质干细胞可以被配制用来通过注射——例如通过弹丸注射或持续灌输——进行肠胃外给药。用于注射的制剂可以以单元剂量形式存在于例如安瓿中或多剂量容器中，其中添加有防腐剂。组合物可以是处于油或含水载体中的悬浮液、溶液或乳状液，可以含有配方试剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地，活性组分可以是粉末形式，其在使用之前与合适的介质，例如无菌无热原的水或其他溶剂重新配制。例如，本文所提供的是稳定化溶液或冻干形式的肠胃外制剂，其中含有有效量的多肽和骨髓间充质干细胞。

17、多肽和骨髓间充质干细胞可以以微粉化或其他合适的形式悬浮，或可以被衍生化以产生更可溶的活性产物或产生药物前体。所得到的混合物的形式取决于许多因素，包括所打算的给药方式以及多肽在所选择的载体或媒介物中的溶解性。有效的浓度足以改善状况的症状并可以经验性地确定。

18、无菌的冻干粉末可以通过将含有多肽和骨髓间充质干细胞溶解在合适的溶剂中或者将含有多肽和骨髓间充质干细胞的溶液的小等份与合适的溶剂相混合而得以制备。所述溶剂可以含有改善该粉末或由该粉末所制备得到的重构溶液的稳定性的赋形剂或其他药理学组分。可以使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或其他合适的试剂。所述溶剂也可以含有缓冲液，诸如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其他这样的缓冲液，这是本领域技术人员所知道的，通常为约中性ph。随后对溶液进行无菌过滤，再在本领域技术人员已知的标准条件下进行冻干，从而得到冻干的制剂。通常，将由无菌过滤获得的溶液分配入小瓶中进行冻干。每个小瓶可以含有单剂量的多肽，诸如10-1000mg或100-500mg，或者含有多倍剂量的多肽。简言之，冻干粉末可以这样来制备，将右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或其他合适的试剂以约1-20％的量溶解于合适的缓冲液例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其它的本领域技术人员所知道的这样的缓冲液中并使ph约为中性。

19、有益效果

20、本发明通过噬菌体库筛选特异性靶向并且抑制nos活性的多肽nos-s2，该多肽能够有效的抑制软骨损伤后的软骨细胞凋亡进而促进软骨损伤的修复。所述多肽与骨髓间充质干细胞联用能够显著的提高治疗效果，应用前景广阔。