一种深渊盐单胞菌溶原性噬菌体及其分离方法和应用

本发明属于海洋生命科学，具体涉及一种新型深海深渊以盐单胞菌作为宿主的溶原性噬菌体。

背景技术：

1、深海病毒最早报道是1968年johnson在国际印度洋航次中从3000 m深海沉积物中分离的弧菌噬菌体( vibrio phage), 由于没有后续的研究, 对该噬菌体的特性了解得很少。在经过了将近40年的停滞之后, 深海病毒的分离工作开始陆续报道。目前只有少量病毒从深海(深度1500~7000 m)中被分离鉴定, 而深海深渊病毒的研究十分稀少，仅有唯一的1株属于深渊病毒（psts-1），分离自日本海沟7000米的海水，是感染假单胞菌（ pseudomonas）的。深海(水深>1000 m) 是海洋最主要的组成部分(覆盖了地球表面积的65%), 有着高压、低温、黑暗、寡营养等多种极端环境条件, 在全球的生物量产生和生物地球化学循环过程中扮演了重要的角色。而深海中深度大于6000米的海域被称为‘深渊’，只占海洋总面积的1.2%。深渊区主要有海沟和海槽两种地形。目前，由于深渊噬菌体的分离十分稀有，对深渊噬菌体的研究，以及深渊中的病毒和细菌的相互作用的了解知之甚少。因此，深渊噬菌体的分离具有十分重要的现实意义和价值。

2、马里亚纳海沟是全球最深的海沟，它是板块俯冲地带，海底地质运动非常活跃，这里是海洋的最深处，水压高，完全黑暗，温度低，含氧量低，且食物资源匮乏，因此成为地球上环境最恶劣的区域之一。马里亚纳海沟具有独特的微生物群落结构，预示着其未知的浮游病毒群落组成。被誉为“地球第四极”的马里亚纳海沟对人类来说仍然是神秘之地，对其中各种生命现象的研究有利于了解地球极端环境下的生物适应机制及其驱动的元素循环。马里亚纳海沟未知的神秘微生物种群的生存除了需面对极端环境(如高压、寒冷、有机物贫瘠)胁迫外，同时还会受到各种病毒侵染的威胁。据报道即使在万米深渊底部的沉积物中，仍然有着较高的病毒生产力。然而目前对于马里亚纳海沟沉积物中底栖病毒的物种组成、生存策略及其生态功能的了解十分有限。因此，深渊噬菌体的分离和研究对于增进马里亚纳海沟及深海环境中底栖病毒的了解至关重要，并将为底栖生态学和生物地球化学等领域提供宝贵的信息。

3、深海微生物有着极高的丰度, 占据了所有水体微生物总量的55%。据推算,仅深海沉积物表层10 cm中的原核生物量就高达160 pg, 相当于地球上微生物总量的30%~45%,因此在整个地球的物质和能量循环中占据着重要的地位。特殊的生存环境造就了深海微生物独特的基因形式、遗传背景及调控机制。近30年来对深海环境中病毒(主要为噬菌体)的研究揭示了其极高的丰度和多样性, 对马里亚纳海沟挑战者深渊全水深海水样品的分析表明, 2000 m以下海水中病毒丰度相对稳定, 保持在(2.2~3.6)×105 vlp/ml的范围内。而深海沉积物中的病毒丰度显著高于深海海水。挑战者深渊底部表层(水深10325 m)沉积物中病毒丰度为2.4×106~5.3×107 vlp/cm3。他们直接或间接地影响着深海细菌和古菌的生命活动, 从而对深海生态系统的运转和平衡发挥着重要的作用。然而，目前对深海深渊病毒的研究仍然非常稀少。深渊噬菌体的分离对深海及深渊病毒的研究具有非常重要的创新价值，对于理解深海生态系统的运转和平衡，以及深渊微生物的适应策略和进化机制具有重要意义。

4、深海深渊极端环境中生存的微生物由于长期适应环境，因此形成了极为特殊的生理机制，并产生多种特殊的物质等，具有很高的研究和利用价值。海洋螺菌目(oceanospirillales)是马里亚纳海沟丰度最高的细菌类群。据报道，它能够降解多种石油烃，应用于石油污染环境的生物修复。

5、在深海病毒群落研究中,深度被认为是造成深海病毒群落丰度及组成显著性差异的重要原。然而，尚需要进一步研究造成这种差异的内在机制。在近海和浅海环境中，已知病毒受到温度、盐度、辐射、营养物、有机/无机颗粒物等环境因子的影响，但在深海环境中，这些因素是否与病毒相关，以及他们的影响程度如何，还需要进一步研究。

6、深海深渊病毒的功能主要包含两大方面：一是由病毒裂解所介导的对物质能量循环的调节(病毒回路)以及对生态系统组成的平衡(种群调节)；二是病毒中代谢相关基因的表达(辅助代谢) 以及病毒对宿主生理活动的影响(环境适应)。然而，目前关于深渊病毒的研究还非常有限。

7、深渊病毒的研究离不开深海环境与极端生命过程两个关键点。高压与寡营养(深部)是深海两个关键环境因子,它们与深海病毒的关系目前还了解极少, 需要尽快建立深海病毒-宿主模式系统, 以深入探讨不同极端环境条件下深海病毒的基因表达调控方式及其与宿主的相互作用关系等问题。

8、总之，深渊病毒在海洋生态系统中具有重要影响，但是由于深渊噬菌体的分离十分有限，我们对深海深渊环境中的病毒知之甚少。因此，深渊噬菌体的分离对研究深海病毒具有十分重要的现实意义和创新价值。

9、海洋病毒通过调节微生物群落结构，参与生物地球化学循环，对海洋生态系统产生深远的影响。如能将深渊中细菌与病毒的相互作用充分挖掘出来，展示出它们在生物地球化学循环中扮演的角色以及调节微生物群落结构的特性，然后加以综合利用，将有望改善海洋生态系统的治理效率，对于海洋生态系统的管理和保护至关重要。

10、深渊噬菌体特殊的特性在遗传工程、基因治疗和转基因动物等领域极也具有重要的现实价值和应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种深渊盐单胞菌溶原性噬菌体，并提供该噬菌体的分离方法，以及提供该噬菌体的应用，以弥补现有技术和研究的不足，从而用以推动深渊病毒、深渊中细菌与病毒相互作用的研究。

2、为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：

3、一种深渊盐单胞菌溶原性噬菌体，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏号为：cgmcc no. 45080，保藏日期为：2022年02月09日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为噬菌体  halomonas phage，命名为噬菌体  halomonas phage 4908。

4、所述噬菌体的全基因组测序序列见序列表中seq no.1（包括seq no.1-1、seqno.1-2、seq no.1-3顺次接续，总计基因组大小为38，630bp）。

5、所述深渊盐单胞菌溶原性噬菌体4908来源于马里亚纳海沟8900米深海沉积物，从深渊盐单胞菌( halomonas boliviensis)中诱导分离得到的一株噬菌体；由于8900米的深渊环境特性是低温，高压，无光，那么该噬菌体具有与其生存环境相匹配的特性，即该噬菌体具有耐低温、耐高压、无光环境下生存等特性；另外该噬菌体与表层海水分离的噬菌体不同，推测其具有特殊代谢通路。

6、进一步的，所述噬菌体为一株温和性噬菌体（temperate phage），属于溶源性噬菌体（ lysogenic phage），能够与宿主共生共存，即该噬菌体与宿主菌共生在硫循环中发挥重要作用。

7、所述噬菌体属于耐盐耐压的海洋螺杆菌目，盐单胞菌科，盐单胞菌属作为宿主的噬菌体，具体为玻利维亚盐单胞菌。

8、所述噬菌体4908宿主细菌属于海洋螺杆菌目 oceanospirillales，盐单胞菌科 halomonadaceae，盐单胞菌属 halomonas，玻利维亚盐单胞菌种 halomonas boliviensis。盐单胞菌属 halomonas，是革兰氏阴性菌群，大多为杆状，是一类能在绝对盐度（nacl）为0～32%条件下生长的耐盐细菌。菌落形态为圆形，乳白色，凸透镜状，边缘完整，菌落直径较大，需nacl才能生长，最适nacl浓度为3%，产淀粉酶、过氧化氢酶，不能水解明胶，硝酸盐还原阳性，不能发酵果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖产酸。

9、一种深渊盐单胞菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏号为：cgmcc no. 24386，保藏日期为：2022年02月09日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为盐单胞菌 halomonas sp. 命名为玻利维亚盐单胞菌 halomonas bolivenasis。

10、所述噬菌体的分离方法包括以下步骤：

11、（1）将活化的盐单胞菌种以5%的接种量接入2216e液体培养基冻存管中，27℃培养过夜。

12、（2）添加丝裂霉素c使其浓度达到1.0 µg/ml，静置培养过夜。

13、（3）上述经丝裂霉素ｃ诱导的变澄清的细菌裂解液5ml，4000 × g离心30min，上清液用0.22µm滤膜过滤，得到不含宿主菌的噬菌体原液，4℃保存。

14、进一步的，所述2216e培养基包括：蒸馏水：1l；海盐：30g；蛋白胨：5g；酵母： 1g；琼脂： 15g；121℃高压灭菌15分钟，冷却后备用。

15、所述噬菌体的基因组测序：

16、更进一步，将上述不含属宿主菌的噬菌体原液，经核酸提取及病毒文库构建，进行全基因组测序，具体是经omega病毒dna核酸提取试剂盒进行核酸提取，送生工测序使用illumina平台进行全基因组测序, 通过trimmomatic进行质控spades进行拼接，确定了噬菌体4908基因组dna的全部核苷酸序列。最终得到噬菌体的全基因组测序序列为：seq no.1（包括seq no.1-1、seq no.1-2、seq no.1-3）。

17、经鉴定，所述噬菌体4908为盐单胞菌噬菌体，拟定为有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。所述噬菌体4908基因组大小为38，630bp， g+c含量54.4%，由49个开放阅读框（orfs）编码；因此，基因序列中共有49个开放阅读框（orf1到orf49），其中有 16种蛋白质无法匹配到数据库中的任何蛋白质，并被注释为假定蛋白。大量的假定蛋白证明许多的功能有待后续研究，我们猜测这与深渊噬菌体与已知的表层海水病毒具有不同的代谢通路以及基因表达有关，因此极具研究价值性。

18、噬菌体4908整个基因组分为以下几个模块：复制和调节，结构，包装，整合，溶菌以及辅助代谢基因amg：

19、复制和调节模块：（1）orf2 dna甲基化酶（methyl-directed repair dna adeninemethylase (ec 2.1.1.72)） 起始位点为2136终止位点为1378，该基因组的存在证明了噬菌体4908携带dna甲基化修饰酶，帮助免疫宿主的非特异性识别系统，促进溶原性感染。（2）orf37为噬菌体阻遏蛋白ci（phage repressor protein ci），起始位点为31565终止位点为30900，特殊的转录调控因子，调控特定的基因表达，可以帮助病毒保持潜伏，保持溶原性感染。在控制噬菌体的溶源裂解途径中扮演着重要的角色，帮助病毒整合到宿主基因组中以及控制裂解过程。阻遏蛋白ci的应用也很广泛，它可以用于粒细胞（比如说骨髓细胞、t细胞等）、巨噬细胞以及b细胞等微生物细胞的调控，也可以用于肿瘤相关的基因表达调控。此外，它还可以用于新药开发及抗病毒治疗中，为病毒治疗及新药开发提供有用的信息。（3）orf29为基因d蛋白，它通过结合到特定的dna序列来调节其表达，从而实现对基因的调控，改变基因的表达。（4）dna聚合酶v。（5）orf45为噬菌体trar/ybii家族蛋白（phage trar/ybii family protein），起始位点为36115终止位点为36330，具有抑制rrna和r蛋白启动子的机制。可以作为转录因子，调控基因转录，将细胞资源转移到噬菌体，以减缓宿主生长并增加噬菌体繁殖增长。

20、组装模块：门户蛋白gpq，噬菌体衣壳支架蛋白gpo，噬菌体主要衣壳蛋白gpn，噬菌体末端酶（ 核酸内切亚基gpm），噬菌体头部完成/稳定蛋白gpl，噬菌体尾卷尺蛋白tmp。尾卷尺蛋白是一种组成噬菌体尾巴的组分，它在吸附时可以帮助噬菌体吸附细菌，并控制尾巴的长度或者是尾巴蛋白亚体的形成，其功能类似于噬菌体的尾巴装配蛋白。这些蛋白可能包括尾巴长度控制蛋白质，尾巴纤维蛋白，尾巴组分蛋白和尾巴亚结构蛋白。控制噬菌体尾巴的形成、装配以及构建整个噬菌体尾巴的部件，如尾丝和尾板。

21、结构模块：噬菌体尾部蛋白x，噬菌体尾部蛋白，噬菌体尾部完成蛋白，基板组装蛋白gpv，噬菌体基板组装蛋白gpw，基板组装蛋白gpj，噬菌体尾部纤维，噬菌体尾丝蛋白，尾丝组装蛋白p37，噬菌体尾鞘单体gpfi，噬菌体主尾管蛋白gpfii，尾蛋白，噬菌体p2 gpe蛋白，噬菌体尾部蛋白gpu。

22、辅助代谢基因amg：（1）orf21为dmt药物/代谢物转运蛋白超家族通透酶（permeaseof the drug/metabolite transporter (dmt) superfamily），起始位点为15692终止位点为16792，负责药物进出细胞的功能，转运dmt及其药物底物，从而实现对dmt代谢物的调控。它介导的氨基酸、多糖、 多肽、神经递质、金属离子、 代谢产物、内外源性毒素和各种药物等物质，以主动方式完成细胞内外的跨膜转运。dmt药物/代谢转运蛋白是其可能的毒力因子。

23、噬菌体溶菌酶，整合酶的蛋白是：（1）orf11为溶菌酶（phage lysozyme r (ec3.2.1.17)），起始位点为8868终止位点为9365，能够帮助核酸进入宿主。（2）orf49为噬菌体整合酶（phage integrase），起始位点为37364终止位点为38530，帮助病毒dna整合到宿主。它是整合位点序列特异性的酶类。由于这一特性，它可用于向染色体定位特异性地导入目的基因，在遗传工程、基因治疗和转基因动物等领域极具应用前景。编码整合酶和溶菌酶说明在深渊这种特殊的环境中，噬菌体4908可根据宿主的生存状态以及环境的影响，选择性的表达不同的蛋白从而切换不同的生活策略，整合在宿主的基因组中或者裂解宿主。这种特殊的机制，我们猜测与深渊高压、低温、黑暗、寡营养等多种极端环境条件有关。

24、所述噬菌体4908能够用以研究深渊中细菌与病毒的相互作用，也可用于向染色体定位特异性地导入目的基因，在遗传工程、基因治疗和转基因动物等领域极具应用前景。

25、本发明的优点和有益效果：

26、本发明提供了一种深渊盐单胞菌噬菌体，噬菌体4908是第一株来源于马里亚纳海沟8900米的深渊溶原性噬菌体。根据目前报道，深渊噬菌体非常稀少溶原性噬菌体也很少。本噬菌体即是深渊噬菌体又是溶原性噬菌体。因此，本噬菌体对未来可用于研究深渊病毒、深渊中细菌与病毒的相互作用有非常重要的意义。

27、本噬菌体属于耐盐耐压的海洋螺杆菌目，海洋螺杆菌噬菌体目前为止只报道了10株。深海深渊极端环境中生存的微生物由于长期适应环境，因此形成了极为特殊的生理机制，并产生多种特殊的物质等，具有很高的研究和利用价值。深海病毒在深海生态系统中有极高的丰度和多样性，并且其在这种特殊的环境中扮演着关键的生态调节者的角色。

28、且根据基因组编码基因分析，本发明分离得到的噬菌体在遗传工程、基因治疗和转基因动物等领域极具应用前景。