本发明涉及一种用于腐霉利检测的比率型电化学适体传感器制备方法，尤其涉及一种基于贵金属/轻金属氧化物/功能化碳纳米复合材料的修饰金电极制备方法。
背景技术：
1、在农作物的种植过程中农药的被使用用来减少虫害去使得作物能够茁壮的成长。其中腐霉利被使用来预防蔬菜和水果的灰霉病，腐霉利是一类有机氯类农药，主要用来抑制甘油三醇的合成，化学名为n-(3,5-二氯苯基)-1,2-二甲基环丙烷-1,2-二甲酰基亚胺，分子式为 c13h11cl2no2，在喷洒农药的过程中腐霉利会通过皮肤接触进入人体，在人体内富集，会对人体健康造成危害，研究发现腐霉利会对哺乳动物的性器官造成危害，导致其畸变、萎缩，在哺乳动物妊娠早期如若接触腐霉利，会对新生婴儿的性别产生影响，并危害其健康。目前检测食品中腐霉利的方法主要有高效液相色谱、液相色谱-串联质谱、气相色谱等，这些方法虽然具有很高的灵敏度和准确度，但需要大型昂贵的仪器设备及复杂的样品纯化制备程序，分析程序复杂，因此，发展检测速度快、仪器设备简单易操作、成本低、适合现场检测的方法是检测食品中腐霉利含量的有效途径之一。电化学传感器操作简单、响应速度快、成本低、仪器设备简单便携、对操作人员技术要求不高，是当前研究的热点。为提高检测性能，常引入核酸适体技术，将核酸适体用于识别元件并与各种电化学转换器相结合构建核酸适体传感器，但在实际应用中，基于单一识别元件核酸适体的电化学传感器仍然存在灵敏度、稳定性和线性响应等指标不够理想的问题，因此利用纳米材料作为信号放大策略以进一步提高传感器的响应灵敏度，因此设计合成轻金属氧化物-贵金属/功能化碳纳米复合材料成为制备高效电化学生物传感器的关键，目前设计合成贵金属/轻金属氧化物/功能化碳纳米复合材料作为电极修饰材料，同时构建适体和互补链连接的纳米材料及信号分子的双信号标签用于腐霉利的检测尚未见报道。
技术实现思路
1、发明本发明涉及一种用于腐霉利检测的比率型电化学适体传感器制备方法。
2、一种用于腐霉利检测的电化学适体传感器制备方法，其步骤如下：
3、所述贵金属/轻金属氧化物/功能化碳纳米复合材料的制备：采用水热合成法制备贵金属/轻金属氧化物/功能化碳纳米复合材料，将1~5 ml 1~5mg/ml功能化碳纳米材料悬浮液、80~160 μl 10~30mg/ml轻金属氧化物溶液、200~800 μl 0.5~2 mg/ml贵金属溶液和1~5ml 2~10mg/ml还原剂进行混合，超声处理10~15 min后，得到均匀的混合溶液，将混合溶液转移至氧化铝坩埚中，通入惰性气体，在400~500℃下加热2~5 h，得到贵金属/轻金属氧化物/功能化碳纳米复合材料；
4、所述步行机和dna发夹的制备:将5~20 μl 5~20μm 修饰信号分子a的腐霉利适配体a-apt和5~20 μl 5~20μm wdna在缓冲液中混合后，通过互补结合得到步行机a-apt-wdna；分别取5~20 μl 1~5μm a-apt-wdna以及5~20 μl 20~80μm hdna混合至于50~100 ml40~120 μm缓冲液中，在30~40℃下孵育40~60 min后，得到dna发夹；
5、所述步行机/发夹dna/信号分子b/贵金属/轻金属氧化物/功能化碳纳米复合材料/金电极的制备：首先，用氧化铝粉抛光金电极，将抛光后的金电极依次置于乙醇和蒸馏水中分别超声处理5~10 min，将金电极浸入强氧化溶液中15~30 min，用蒸馏水冲洗干燥；然后，将2~5 ml轻金属材料-贵金属/功能化碳纳米复合材料分散在2~5ml超纯水中，然后超声5~10 min，将2~5 μl悬浮液滴在金电极表面，并在50~80℃下干燥10~30 min，将1~5 μm10~30 μl信号分子b溶液滴加在金电极表面并孵育0.5~1.5 h；随后，将5~10 μl 1~5 mm 封闭剂滴加在金电极表面孵育40~80 min以阻断活性位点；最后，在金电极表面上滴加5~10 μl步行机和5~10 μl发夹dna并孵育过夜；即得到步行机/发夹dna/信号分子b/贵金属/轻金属氧化物/功能化碳纳米复合材料/金电极，每步操作后用缓冲溶液冲洗修饰后的电极以去除未结合的物质并干燥；
6、所述电化学传感器是以步行机/发夹dna/信号分子b/贵金属/轻金属氧化物/功能化碳纳米复合材料/金电极为工作电极,加入exo i和不同浓度的腐霉利后，步行机在电极表面不断循环打开发夹dna，通过信号分子a和信号分子b的响应信号比值变化来指示样品中腐霉利含量，得到了用于腐霉利含量检测的比率型电化学适体传感器；
7、所述的功能化碳纳米材料为聚二甲基二烯丙基氯化铵化石墨烯、功能化碳纳米材料为多壁碳纳米管、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、生物质多孔碳、聚二甲基二烯丙基氯化铵化石墨烯、聚多巴胺化石墨烯、石墨烯中的一种或多种；所述的氨基官能化试剂为阳离子聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、二氨基对苯二酸一种或多种；
8、所述的轻金属氧化物为硝酸钛酰、二氧化钛、硝酸镁、氧化铝中的一种或多种；
9、所述的贵金属为金、铑、钯、银、铂中的一种或多种；
10、所述的还原剂为硼氢化钾、甘氨酸、四氢锂铝、甲酸中的一种或多种；
11、所述的惰性气体为氮气、氦气、氩气中的一种或多种；
12、所述的缓冲溶液为tris-hcl缓冲溶液、pbs缓冲溶液、三乙醇胺、hepes溶液、2-(n-吗啡啉)乙磺酸、tnak缓冲液中的一种或多种；
13、所述的信号分子a为硫堇、亚甲基蓝、二茂铁、中性红中的一种或多种；
14、所述的信号分子b为硫堇、亚甲基蓝、二茂铁、中性红中的一种或多种；
15、所述的缓冲溶液为tris-hcl缓冲溶液、pbs缓冲溶液、三乙醇胺、hepes溶液、2-(n-吗啡啉)乙磺酸、tnak缓冲液中的一种或多种；
16、本发明涉及的传感器中，以步行机/发夹dna/信号分子b/贵金属/轻金属氧化物/功能化碳纳米复合材料/金电极的工作电极，同其它用于腐霉利含量检测的电化学传感器相比，所制备的新型双信号适体传感器具有灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。
17、实施方式
18、下面结合具体实施例对本发明进行描述：
19、实施例
20、具体步骤如下：
21、（1）首先采用水热法制备ag/tio2/氮化石墨烯纳米复合材料，将5 ml 2mg/ml 氧化石墨烯 (go) 悬浮液、50 ml tio(no3)2，100 μl 20mg/ml agno3和2ml 5mg/ml甘氨酸进行混合，超声处理10 min后，得到均匀的混合溶液，将混合溶液转移至氧化铝坩埚中，通入氮气，在500℃下加热2 h，得到ag/tio2/氮化石墨烯纳米复合材料。
22、（2）将20 μl 15μm 二茂铁的腐霉利适配体二茂铁-apt和20 μl 10μm wdna在tnak缓冲液（20 mmtris，140 mmnacl，5 mmkcl，ph=7.4）中混合后，通过互补结合得到步行机二茂铁-apt-wdna；分别取20 μl 5μm 二茂铁-apt-wdna以及20 μl 50μm hdna混合至于tnak缓冲液中，在35℃下孵育60 min后，得到dna发夹。
23、（3）所述步行机/发夹dna/二茂铁/ag/tio2/氮化石墨烯纳米复合材料/金电极的制备：首先，用氧化铝粉抛光金电极，将抛光后的金电极依次置于乙醇和蒸馏水中分别超声处理5 min，将金电极浸入体积比7:3的浓硫酸与过氧化氢溶液中20 min，用蒸馏水冲洗干燥；然后，将3 mlag/tio2/氮化石墨烯纳米复合材料分散在5ml超纯水中，然后超声5 min，将5 μl悬浮液滴在金电极表面，并在60℃下干燥30 min，将5 μl 20 μm二茂铁溶液滴加在金电极表面并孵育1 h；随后，将5 μl 1 mm mch滴加在金电极表面孵育60 min以阻断活性位点；最后，在金电极表面上滴加5 μl步行机和5 μl发夹dna并孵育过夜；即得到步行机/发夹dna/二茂铁/ag/tio2/氮化石墨烯纳米复合材料/mch/金电极，每步操作后用缓冲溶液冲洗修饰后的电极以去除未结合的物质并干燥。
24、（4） 电化学传感器是以步行机/发夹dna/二茂铁/ag/tio2/氮化石墨烯纳米复合材料/mch/金电极为工作电极,加入exo i和不同浓度的腐霉利后，步行机在电极表面不断循环打开发夹dna，通过亚甲基蓝和二茂铁的响应信号比值变化来指示样品中腐霉利含量，得到了用于腐霉利含量检测的比率型电化学适体传感器。
25、所制备的电化学传感器对腐霉利的检测具有准确度高，线性范围宽（1×10-10~ 1×10-6 mol/l），检测下限低（1×10-10 mol/l）的特点，同时，对实际样品(如玉米、水果)的检测结果表明所制备的传感器具有非常好的实际应用价值。
26、以上实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变。在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不同于上述的其它实现方式，选用其它试剂材料、调整孵育时间等方法均在本发明专利要求范围之内。