一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌及其制备方法与应用

本发明属于微生物及发酵工程，具体涉及一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌及其制备方法与应用。

背景技术：

1、纤维素合成酶能够催化合成胞内外纤维素或具有纤维素类似结构的多糖，纤维素合成酶家族蛋白还包含一些纤维素合成酶类似蛋白(csl)序列的亚家族，如csla。csla被证明是编码具有1,4-β-聚糖合成酶活性的酶，其主要存在于柱状黄杆菌(flavobacteriumcolumnare)、水合链霉菌(streptomyces hyderabadensis)、白色链霉菌(streptomycesalbus)、红灰链霉菌(streptomyces rubrogriseus)和天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)等细胞中。

2、微生物固定化技术，是利用物理或化学手段将游离细胞定位于限定的空间区域并使其保持活性和可以反复使用的一种基础技术。传统的固定化方法如交联固定化、包埋固定化和共价结合法导致细胞在固定化过程中易失活、细胞因物理空间限制难以长期繁殖生长、介质生物相容性差、稳定差、传质困难，因而不适合长时间连续发酵。相比之下，细胞在固体介质表面通过界面吸附、细胞聚集、细胞生长所形成的生物膜体系(biofilm)能够避免以上缺陷，是一种适合工业长期连续发酵(包括反复批次发酵)的细胞固定化方法。微生物通过自行分泌胞外多糖等生物粘附物质稳定地吸附在固体载体表面，无需其他固定化试剂的使用，即可形成具有一定三维架构和群体生活特征的生物膜体系。生物膜可提高细胞在恶劣环境下的存活率，能够增强细胞在基因表达、生长代谢、生理行为等方面的协作，提高整个群落的适存及代谢能力。基于生物膜的吸附固定化发酵，密度高、活性高、抗逆性好，能够为细胞创造有益的生长微环境。

3、谷氨酸棒状杆菌一直受到研究人员和工业界的青睐，是一种普遍被用于生产赖氨酸、谷氨酸等氨基酸、琥珀酸等有机酸、透明质酸等多糖、蛋白质、维生素以及生物燃料的重要工业细菌。

4、基于生物膜的吸附固定化发酵技术已经在许多菌株中得到了利用，已有研究通过失活或过表达谷氨酸棒状杆菌自身一些内源基因强化了谷氨酸棒状杆菌生物膜体系。本发明拟考察异源表达纤维素合成酶类似蛋白csla对谷氨酸棒状杆菌生物膜的影响。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌。

2、本发明还要解决的技术问题是提供上述重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法。

3、本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组谷氨酸棒状杆菌的应用。

4、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

5、针对第一个技术问题，本发明提供了一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌，该重组谷氨酸棒状杆菌异源表达了纤维素合成酶类似蛋白csla。

6、其中，所述的纤维素合成酶类似蛋白csla来源于链霉菌streptomyces，其蛋白序列长度通常在400-900aa之间，具有β-1,4糖基转移酶催化活性，可催化酶学分类号[ec:2.4.1.-]下的反应，优选催化酶学分类号[ec:2.4.1.12]下的反应，与大肠杆菌纤维素合成酶bcsa(uniprot数据库编号为p37653)的蛋白序列相似性在20％，或者30％，或者40％，或者50％，或者60％，或者70％，或者80％，或者90％以上。

7、其中，所述的纤维素合成酶类似蛋白csla的结构预测表明，该蛋白含有与pfam03552(纤维素合成酶)和pf00535(糖基转移酶家族2)相匹配的结构域。大肠杆菌的bcsa蛋白是细菌中传统纤维素合成主要相关蛋白，在细菌纤维素合成中起着关键作用，而纤维素的形成有助于生物膜和粘附基质的形成，增强细菌的适应能力和存活能力。本发明所述的csla属于类似蛋白，且具有纤维素合成方面的功能，这意味着它可能与大肠杆菌的bcsa蛋白具有相似的功能。通过将不同来源的csla纤维素合成酶类似蛋白与大肠杆菌纤维素合成酶bcsa的蛋白序列进行比较，可以帮助我们推测其功能、预测其结构，以及了解其在细菌纤维素合成中的进化关系。

8、优选的，所述的纤维素合成酶类似蛋白csla可以来源于表1所列链霉菌属中的任意一种，只要与大肠杆菌纤维素合成酶bcsa的蛋白序列相似性≥20％，且具有β-1,4糖基转移酶活性即可。

9、在本发明的一些实施例中，所述的纤维素合成酶类似蛋白csla来源于天蓝色链霉菌streptomyces coelicolor，其氨基酸序列长度如seq id no.1所示。

10、表1纤维素合成酶类似蛋白csla来源情况

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13、针对第二个技术问题，本发明提供了一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，通过将纤维素合成酶类似蛋白csla的基因连接到游离表达质粒或者整合表达质粒，再转化入宿主谷氨酸棒状杆菌中得到的。

14、其中，所述的游离表达质粒包括但不限于pec-xk99e、pxmj19等，现有技术中只要能够满足纤维素合成酶类似蛋白在谷氨酸棒状杆菌中进行游离表达的质粒均适用于本发明。

15、在本发明的一些实施例中，所述的游离表达质粒为pxmj19。

16、其中，所述的整合表达质粒包括但不限于pk18(19)-mobsacb、pjys3_crtyf等，现有技术中只要能够满足将纤维素合成酶类似蛋白整合在谷氨酸棒状杆菌细胞基因组上进行表达的质粒均适用于本发明。

17、在本发明的一些实施例中，所述的整合表达质粒为pjys3_crtyf。

18、具体的，在本发明的一些实施例中，表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法为(一)或(二)中的任意一种。

19、在菌株构建前，首先从ncbi上查到任一所需纤维素合成酶类似蛋白csla的蛋白质序列，例如在本发明的一些实施例中，纤维素合成酶类似蛋白csla来源于天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)，序列如seq id no:1所示。根据谷氨酸棒状杆菌的密码子使用偏好性，对csla序列进行密码子优化后，人工合成csla序列于puc57质粒中，得到重组质粒puc57-csla，备用。

20、表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法(一)：

21、以puc57-csla质粒为模板，扩增csla基因，将得到的csla基因片段连接到经ecori/hindiii酶切过的pxmj19质粒上，筛选得到正确的重组质粒pxmj19-csla，将正确的重组质粒再转化到宿主谷氨酸棒状杆菌中即得到重组菌株cg-csla。

22、表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法(二)：

23、将经密码子优化后的csla基因片段整合至已报道的基因组上的合适位点，在本发明第(二)种重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法中，整合到已报道的exer基因位点(该位点信息已公开在专利cn109337854a中，其核苷酸序列如seq id no.2所示)。对谷氨酸棒状杆菌原始菌株的基因组进行pcr，得到exer基因敲除位点的上游同源臂片段exer-r(seq idno.3)和下游同源臂片段exer-l(seq id no.4)；对谷氨酸棒状杆菌原始菌株的基因组进行pcr，得到在基因组上启动csla表达的peftu启动子片段(seq id no.5)；以puc57-csla质粒为模板，扩增csla基因，得到需要整合到exer位点的csla基因片段；以质粒pjys3_crtyf为模板进行pcr，扩增crrna序列及21bp crispr-cpf1识别序列，得到exer-n21片段(seq idno.6)。

24、将exer-r片段、peftu启动子片段和csla基因片段纯化后等量混合，进行overlappcr，将得到的片段命名为片段a；将exer-l片段和exer-n21片段纯化后等量混合，进行overlap pcr，将得到的片段命名为片段b。最后将片段a和片段b连接到经apai/swai酶切过的pjys3_crtyf质粒上，筛选得到正确的重组质粒pjys3-△exer::csla，将重组质粒转化到宿主谷氨酸棒状杆菌中即得到重组菌株cg-△exer::csla。

25、其中，所述的宿主谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌cg-0206，该菌株是通过谷氨酸棒杆菌cicc 21763诱变所得的赖氨酸生产菌，其信息已公开在文章中(lei m,peng x,sun w,et al.nonsterile l-lysine fermentation using engineered phosphite-growncorynebacterium glutamicum[j].acs omega,2021,6(15):10160-10167.)。

26、利用结晶紫染色法表征重组菌株cg-csla、cg-△exer::csla以及原始菌株cg-0206生物膜形成效果，发现表达纤维素合成酶类似蛋白csla后，能明显提高谷氨酸棒状杆菌的生物膜，其中质粒游离表达的重组菌株cg-csla的效果最好，生物膜提高约1.35倍。

27、针对第三个技术问题，本发明提供了一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌在微生物发酵中的应用。

28、其中，所述的微生物发酵包括赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸等氨基酸发酵，琥珀酸等有机酸发酵，透明质酸等多糖发酵，以及蛋白质、维生素、生物燃料等好氧或者厌氧发酵。

29、该应用的主要目的是利用所述重组谷氨酸棒状杆菌提高各微生物发酵过程的生产效率。其中，所述的发酵过程为：将上述重组谷氨酸棒状杆菌先在种子培养基中进行培养得到种子液，待种子液菌体生长的光密度(od562)数值达到2-10之间，将重组谷氨酸棒状杆菌的种子液以2％-20％v/v的接种量接到发酵培养基中发酵即得到含发酵产物的发酵液。

30、在本发明的一些实施例中，上述重组谷氨酸棒状杆菌具体应用于发酵制备赖氨酸中。

31、其中，所述的发酵包括游离发酵和/或吸附固定化反复批次发酵。

32、具体的，所述得游离发酵，是指在发酵培养基中不加入载体介质，细胞游离悬浮在液体发酵培养基中进行发酵。

33、具体的，所述的吸附固定化反复批次发酵是指在每一批发酵结束后，倒出全部或部分发酵液而保留发酵体系中的固体化载体介质(其上含有生物膜)，然后加入新鲜的发酵培养基继续进行下一批次的发酵，如此反复进行。

34、其中，所述的游离发酵和/或吸附固定化反复批次发酵，其种子培养基配方为：15-35g/l蔗糖、5-15g/l蛋白胨、1-10g/l酵母粉、5-10g/l硫酸铵、0.1-1g/l七水硫酸镁、1-5g/l磷酸二氢钾、5-15g/l磷酸氢二钾、1-5g/l尿素，溶剂为水；其培养条件为：在28-34℃，200-250rpm条件下培养4-8h。

35、优选的，所述的种子培养基配方为：25g/l蔗糖、10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉、5g/l硫酸铵、1g/l七水硫酸镁、5g/l磷酸二氢钾、12g/l磷酸氢二钾、5g/l尿素，溶剂为水；所述的培养条件为：在30℃，220rpm条件下培养至od562为2-10。

36、其中，所述的游离发酵和/或吸附固定化反复批次发酵，其发酵培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、缓冲剂和辅助因子。

37、具体的，所述的碳源包括葡萄糖和糖蜜中的任意一种或两种的组合，优选80-120g/l葡萄糖，更优选100g/l葡萄糖。

38、具体的，所述的氮源包括酵母提取物、硫酸铵、尿素、玉米浆、蛋白胨和豆粕粉中的任意一种或几种的组合，优选5-15g/l酵母提取物、5-15g/l尿素和10-20g/l硫酸铵的组合，更优选10g/l酵母提取物、10g/l尿素和15g/l硫酸铵的组合。

39、具体的，所述的无机盐包括p5+、k+、cu2+、mn2+、zn2+和fe2+中的任意一种或几种的组合，优选0.5-1.5g/l七水合硫酸镁、1-5g/l磷酸氢二钾、100-300mg/l硫酸亚铁、100-200mg/l硫酸锰、0.5-2mg/l硫酸铜和0.5-2mg/l硫酸锌的组合，更优选0.8g/l七水合硫酸镁、2.5g/l磷酸氢二钾、150mg/l硫酸亚铁、100mg/l硫酸锰、1mg/l硫酸铜、1mg/l硫酸锌的组合。

40、具体的，所述的缓冲剂包括碳酸钙的水溶液和mops中的任意一种或两种的组合，优选40-50g/l mops，更优选42g/l mops。

41、具体的，所述的辅助因子包括烟酰胺、右旋泛酸钙、维生素b1和生物素中的任意一种或几种的组合，优选40-80mg/l烟酰胺、5-15mg/l右旋泛酸钙、5-15mg/l维生素和0.5-2mg/l生物素的组合，更优选50mg/l烟酰胺、10mg/l右旋泛酸钙、10mg/l维生素b1、2mg/l生物素的组合。

42、其中，所述的游离发酵和/或吸附固定化反复批次发酵，其发酵培养条件为：在28-34℃，200-250rpm条件下发酵18-36h，至葡萄糖消耗殆尽，优选的发酵条件为：30℃，220rpm条件下发酵24h。

43、其中，所述的发酵过程中质粒游离表达菌株cg-csla需加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷iptg；优选的，所述的发酵过程中加入0.01-1mm的iptg；优选的，加入0.5mm的iptg。

44、其中，所述的吸附固定化反复批次发酵，其载体介质为棉纤维、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆中的任意一种或几种的组合，优选棉纤维。

45、其中，所述吸附固定化反复批次发酵，其载体介质的用量为5-40g/l；优选30g/l。

46、在吸附固定化反复批次发酵产赖氨酸中，改造后的重组菌株赖氨酸产量均比原始菌高，其中重组菌株cg-csla产量提高约17％。

47、待吸附固定化反复批次发酵结束后，利用sem表征各菌株的生物膜量，结果发现两种重组菌株的生物膜均比原始菌株更厚，棉纤维载体上附着的菌体更多，菌体表面分泌的胞外聚合物(eps)更多，而原始菌株的生物膜较薄。

48、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

49、(1)本发明通过异源表达纤维素合成酶类似蛋白csla，能够有效提高细胞在多种介质表面吸附生长的能力，并提高谷氨酸棒状杆菌细胞在多种发酵过程中的发酵强度和生产效率。

50、(2)本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌吸附固定化发酵产赖氨酸的应用，利用固体材料作为谷氨酸棒状杆菌吸附生长的载体介质，并应用于吸附固定化反复批次发酵生产过程，从而可以反复利用菌体细胞，能够实现连续化发酵。

51、(3)本发明构建的表达纤维素合成酶类似蛋白csla的重组谷氨酸棒状杆菌，增强了谷氨酸棒状杆菌的代谢水平和耐受性，在游离发酵和吸附固定化反复批次发酵中使得谷氨酸棒状杆菌的发酵效率得到了提高，其中在吸附固定化反复批次发酵中重组菌株cg-csla产赖氨酸的产量较原始菌株提高了17％以上。