一种PET降解工程菌的构建及应用

本发明涉及一种pet降解工程菌的构建及应用，属于微生物工程。

背景技术：

1、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)是塑料的一种，因其具有高机械强度、低透气性、重量轻、成本价格低等优点，目前已在全世界范围内得到了广泛的应用。大量pet废弃物在自然状态下难以降解，导致pet在全球生态体系中积累使得土地营养成分流失土壤板结，并且大量漂流在海洋上的塑料会对海洋生态系统造成不利影响。

2、生物降解技术因其具有绿色无污染以及成本低等优势，而逐渐成为塑料降解领域的研究热点。已报到的微生物对pet的降解效率普遍偏低，如ideonella sakaiensis 201-f6对聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)的降解速率为0.13mg/d(science,2016,351:1196-1199)。在常温(30-35℃)下，pet链处于不活跃状态，与降解酶的结合率大大降低，从而影响了pet降解效果。目前，pet降解酶在高温环境是对pet的降解效率明显高于常温状态，如lcc、iccg、角质酶等(biochemistry 2018,57:1190-1200)。随着基因工程技术的发展，人们逐渐意识到获得一株降解pet的嗜热菌，并将外源高效pet降解酶导入其中，获得pet降解工程菌，实现pet的快速降解。目前pet降解酶导入嗜热菌构成工程菌降解pet的研究较少，所以获得其嗜热pet降解工程菌对pet的降解具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是通过基因工程技术，提供一种可在嗜热pet降解菌科恩氏菌cohnella laecitibosi(公开于公开号为cn115044510a的专利申请文件中)中分泌表达pet降解酶的表达载体及其重组工程菌在pet降解中的应用，为减少pet塑料废弃物迅速积累提供了一个生物降解途径。

2、本发明提供了pet降解酶的表达单元，含有从5'端向3'端顺序的启动子、信号肽、rbs、pet降解酶编码基因和蛋白翻译终止子。

3、在一种实施方式中，所述pet降解酶表达单元中，所述的启动子为组成型表达启动子。

4、在一种实施方式中，所述启动子为pamyq、pylb、papre、pnpre或ptufa。

5、在一种实施方式中，所述启动子为ptufa，所述启动子ptufa核苷酸序列如seq idno.2所示。

6、在一种实施方式中，所述所述启动子pamyq、pylb、papre或pnpre

7、在一种实施方式中，所述蛋白翻译rbs序列ecrbs的核苷酸序列为aaaggagg。

8、在一种实施方式中，所述的信号肽为分泌表达信号肽。

9、在一种实施方式中，所述的信号肽为枯草芽孢杆菌蛋白分泌表达信号肽。

10、在一种实施方式中，所述的信号肽为spcsn、spyncm、splyte、spnprb或spyfkd。

11、在一种实施方式中，所述信号肽spyncm的氨基酸序列为seq id no.3所示；核苷酸序列如seq id no.4所示。

12、在一种实施方式中，所述的pet降解酶为thermobifida fusca菌来源的角质酶(tfc)或其突变体、ideonella sakaiensis 201-f6来源pet降解酶(petase)或其突变体、落叶堆肥来源的角质酶(iccg)或其突变体、saccharomonospora viridis ahk190来源的cut190或其突变体和bacterium hr29来源的bhrpetase或其突变体。

13、在一种实施方式中，所述角质酶tfc含有seq id no.5所示的氨基酸序列，或具有与seq id no.5所示的序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％同源性的氨基酸序列。

14、在一种实施方式中，编码所述角质酶tfc的核苷酸序列如seq id no.6所示。

15、在一种实施方式中，所述pet降解酶petase含有核苷酸序列如seq id no.8编码的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％同源性的氨基酸序列。

16、在一种实施方式中，所述角质酶iccg含有核苷酸序列如seq id no.9编码的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％同源性的氨基酸序列。

17、在一种实施方式中，所述cut190含有核苷酸序列如seq id no.10编码的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％同源性的氨基酸序列。

18、在一种实施方式中，所述bhrpetase含有核苷酸序列如seq id no.11编码的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％同源性的氨基酸序列。

19、在一种实施方式中，上述pet降解酶表达单元中，所述的组成型表达终止子为teminator_1，核苷酸序列如seq id no.7所示；所述的组成型表达终止子还可以为teminator_2，核苷酸序列如seq id no.16所示；所述的组成型表达终止子还可以为teminator_3，核苷酸序列如seq id no.17所示；所述的组成型表达终止子还可以为teminator_4，核苷酸序列如seq id no.18所示；所述的组成型表达终止子还可以为teminator_5，核苷酸序列如seq id no.19所示。

20、在一种实施方式中，pet降解酶表达单元ptufa+ecrbs+spnprb+tfc+teminator_1的核苷酸序列如seq id no.1所示。

21、在一种实施方式中，pet降解酶表达单元ptufa+ecrbs+spyncm+petase+teminator_1的核苷酸序列如seq id no.12所示。

22、在一种实施方式中，pet降解酶表达单元ptufa+ecrbs+spyncm+iccg+teminator_1的核苷酸序列如seq id no.13所示。

23、在一种实施方式中，pet降解酶表达单元ptufa+ecrbs+spyncm+cut190+teminator_1的核苷酸序列如seq id no.14所示。

24、在一种实施方式中，pet降解酶表达单元ptufa+ecrbs+spyncm+bhrpetase+teminator_1的核苷酸序列如seq id no.15所示。

25、本发明还提供了包含所述pet降解酶表达单元的表达载体。

26、在一种实施方式中，所述载体为质粒载体或者病毒载体。

27、在一种实施方式中，所述的质粒载体为pub110、pnw33n、pmsr10、pht01或pth1mp系列的骨架载体。

28、在一种实施方式中，所述的载体为pnw33n。

29、本发明还提供了能够分泌表达pet降解酶的嗜热底盘细胞。

30、在一种实施方式中，所述嗜热底盘细胞为原核细胞或真核细胞。

31、在一种实施方式中，所述的原核细胞为细菌细胞。

32、在一种实施方式中，所述的嗜热底盘菌为科恩氏菌。

33、在一种实施方式中，所述嗜热底盘菌是保藏编号为cctcc no：m 20211351的科恩氏菌(cohnella laecitibosi)，已公开于公开号为cn115044510a的专利申请文件中。

34、进一步的，本发明提供了上述pet降解工程菌的构建方法。

35、在一种实施方式中，所述方法是在底盘细胞中引入所述表达单元。

36、在一种实施方式中，所述方法是在底盘细胞中引入含有所述表达单元的质粒，引入质粒的方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、热激法、氯化锂法、醋酸锂法、显微注射法、脂质转染法等。

37、本发明还提供了一种降解pet的方法，将所述pet降解工程菌与含pet的材料接触。

38、在一种实施方式中，所述方法是将所述pet降解工程菌在培养基中与含pet的材料共培养，以实现pet的降解。

39、在一种实施方式中，所述方法是在40～80℃，或50～70℃，或55～65℃，或55～60℃，或60～65℃处理至少2h，或至少4h，或至少6h，或至少8h，或至少10h，或至少12h。

40、在一种实施方式中，所述含pet的材料是聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)和至少一种其他组分的产品或材料，包括但不限于塑料板、管、棒、异型材、型材、纤维等。

41、在一种实施方式中，所述含pet的材料包括但不限于包装材料(刚性或柔性包装)、农用薄膜、一次性物品等、地毯碎片、织物、纺织品无纺布，地板覆盖物，塑料废物或纤维废物等。

42、在一种实施方式中，所述其他组分包括但不限于聚合物如聚酯、聚酰胺、聚烯烃和乙烯基聚合物、金属化合物、无机化合物、纤维、纸、玻璃化合物、木、木化合物如木质素、纤维素或半纤维素、淀粉、及其衍生物。

43、有益效果：

44、(1)本发明提供了pet降解酶的表达单元、含有该pet降解酶分泌表达单元的质粒，可有效实现pet降解酶在微生物细胞，尤其是科恩氏菌中的分泌表达。

45、(2)本发明提供了能够高效降解pet的工程菌，相比野生菌，其降解率得到了显著的提高，12h内对pet的降解率可超90％，20h即可实现pet塑料的100％降解。

46、(3)本发明所述的表达载体及其宿主细胞可应用于pet塑料生物降解领域，简便高效的降解pet塑料废弃物。