一种快速检测捕食螨携带致病微生物的方法

本发明属于生物，具体涉及一种快速检测捕食螨携带致病微生物的方法。

背景技术：

1、捕食螨是农业生产中应用极为广泛的天敌类群，在病虫害绿色防控中起着举足轻重的作用。目前捕食螨的商业化生产在农业商品市场中相当成熟，除政府补贴外，农户也有极大购买热情和田间实际需要。作为活体生物，捕食螨商品在生产过程中会被多种环境因素影响之后在田间应用的捕食能力，例如温度、湿度、光照、营养不足和微生物致病菌存在均会危害捕食螨健康。其中，饲养过程中环境因素导致的发育不良可在镜检时通过体型大小得以区分，而致病菌感染几乎不能通过常规观察方法检测到。而致病菌不仅会降低捕食螨的捕食量，也会大大减少后代繁殖量，从而影响捕食螨种群在田间的定殖和长期防控作用。

2、欧洲学者schütte等曾在2006年在世界重要商业捕食螨天敌智利小植绥螨中发现致病菌acaricomesphytoseuili，然而全球范围内仅在欧洲的智利小植绥螨种群内发现，检测的美洲和大洋洲其他种群或其他捕食螨种类中均未发现(schütte c,gols r,kleespiesrg,poitevin o,dicke m.novel bacterial pathogen acaricomesphytoseiuli causessevere disease symptoms and histopathological changes in the predatory mitephytoseiulus persimilis(acari,phytoseiidae).jinvertebrpathol.2008jun；98(2):127-35.)。随后则再无研究，直到2022年申请人在国内的智利小植绥螨中也检测到有a.phytoseuili，同时还传染了国内本土的加州新小绥螨(xie z,hoffmann aa,zhang b,xux.detection,detrimental effects,and transmission pathways of the pathogenicbacterium acaricomesphytoseiuliin commercial predatorymites.microbiolspectr.2022dec 21；10(6):e0265422.)。

3、在商业化捕食螨产品中发现该致病菌可致捕食螨取食量减少，加速捕食螨个体死亡，同时由于营养问题导致后代数量急剧减少，致使其在田间防治效率降低并且无法长期防治。除此以外，致病菌对其他捕食螨种类的危害尚未有任何报道与发现。目前国内大量饲养和销售捕食螨的天敌工厂多达百余家，生产包括智利小植绥螨、加州新小绥螨、斯氏钝绥螨、胡瓜新小绥螨等十多个捕食螨种类，一旦在生产环境中存在致病菌，将对所有的捕食螨种类造成灭顶之灾。

4、然而到目前为止，我国生物防治使用捕食螨天敌商品管控仅检测数量是否达标，却并未考虑抽检商品质量，即并未把致病菌作为商品质量标准的一项内容。因此提升捕食螨商品质量会增加天敌生产公司的准入门槛，也会增强农户使用捕食螨商品信心。如农户购买了质量不合格的捕食螨产品，使用后达不到有效防控害虫的目的，也会错失田间虫害防控的最佳时期，同时会动摇农户购买和再次使用天敌的积极性，从而更加依赖化学农药，与我国大力推行害虫绿色防控的方针相悖。

技术实现思路

1、本发明目的是改进捕食螨天敌的质量控制，增加标准检测方法，提升捕食螨产品不同批次的稳定性和可靠性。

2、本发明通过有害菌a.phytoseiuli的分子鉴定三步法，可以解决商品化捕食螨产品的质量控制。

3、本发明提供一种快速检测捕食螨携带致病微生物的方法，具体方法如下：

4、1、研磨捕食螨提取总核酸。具体使用dna提取试剂盒(例如qiagen dneasy blood&tissue kit，商品号69506)抽提捕食螨及其体内所有微生物的总dna。更具体地，首先随机抽取捕食螨商品包装中的10-20头成螨放在1.5ml的离心管中，加入50μl裂解液使用研磨棒将捕食螨个体磨碎，并放置在37℃下裂解2小时，随后的提取步骤按照试剂盒要求进行，最后使用30μl超纯水溶解dna后备用。

5、2、扩增致病微生物，采用引物扩增a.phytoseiuli的基因，优选为16s核糖体基因。

6、具体地，使用特异性引物(f:acgtgagtaacctgcccaa；r:ccaccgctacaccaggaat)通过常规pcr扩增a.phytoseiuli的16s核糖体基因。具体操作中，使用高保真dna扩增酶的25μl扩增体系，加入5μl的dna模板，12.5μl pcr缓冲液，2.5μl扩增酶和混合的特异性引物各0.5μl，4μl超纯水，并在pcr仪中设置如下程序：98℃30秒；35个循环的98℃10秒,55℃20秒和72℃，最后使用72℃5分钟结束扩增。

7、另外更优选地，利用荧光定量pcr(qpcr)方法进行检测。其中利用的引物为：f:cgtgagtaacctgcccaag；r:ggccattaccccaccatca。其次，qpcr条件：利用前述引物，进行real-time qpcr，使用sybr mixture 20μl扩增体系，加入1μl的dna模板，10μl的sybrmixture，及混合的特异性引物各0.5μl，超纯水8μl，使用仪器设置如下程序：95℃10分钟；40个循环的95℃20秒，60℃20秒和72℃30秒。

8、3、检测扩增产物：对前述常规pcr来说，通过琼脂糖凝胶电泳或通过测序确定确认致病菌条带。优选地，采用1％琼脂糖凝胶电泳确认致病菌条带。具体操作中，将pcr扩增产物在180v电压下完成1％琼脂糖凝胶电泳，使用d2000为标记，如在500bp附近有条带，即说明捕食螨被致病菌侵染，条带越亮说明致病菌越多。或者通过检测扩增产物中致病性条带的丰度，丰度越高表明致病菌越多。

9、对于qpcr反应检测来说，在72℃扩增阶段采集荧光如检测到明显峰值，即为致病菌存在，峰值高低与致病菌含量相关，即菌量越多，峰高越高。

10、相应的，本发明提供用于快速检测捕食螨携带致病微生物的试剂盒，其包括针对扩增a.phytoseiuli的16s核糖体基因的引物，优选地其引物为f:acgtgagtaacctgcccaa；r:ccaccgctacaccaggaat；或者引物为f:cgtgagtaacctgcccaag；r:ggccattaccccaccatca。

11、任选地，还包括pcr扩增反应所需的试剂，包括pcr缓冲液，扩增酶；或者包括qpcr反应所用到的试剂。进一步还包括提取捕食螨总核酸的试剂。

12、由此，也提供所述的试剂盒在快速检测捕食螨是否携带致病微生物中的应用。

13、常规pcr操作简单，便宜快速，对实验条件要求不高；荧光定量pcr对致病菌的含量检测更精准，但对实验仪器和操作人员技术要求较高。在捕食螨致病菌进行检测时，可先使用常规pcr的方法进行粗筛，当没有阳性条带时，同一份dna样本可再使用荧光定量pcr方法进行高精度检测。通过以上两种方法搭配，既可以检测捕食螨商品的致病菌污染情况，也能及时检测天敌饲养环境中是否存在致病菌，为减少不合格捕食螨天敌产品的风险。

14、本发明操作方便，简单易行，可以在捕食螨生产过程中快速检测致病微生物的存在，确保捕食螨产品质量，从而具有广阔应用前景。本方法可以快速鉴定捕食螨的主要致病菌a.phytoseuili，确认捕食螨天敌商品是否存在质量隐患。通过快速pcr检测方法，解决无法用常规观察方法或常规微生物培养费时费力的问题，从而确保天敌生产厂家的饲养种群以及田间投放捕食螨产品不携带致病菌，确保捕食螨的商品质量合格，使用后达到有效防控害虫的目的，同时增强农户购买和长期使用天敌的积极性，减少化学农药的使用量。