辣椒抗白粉病InDel标记及其在育种材料筛选鉴定中的应用

本发明属于植物生物工程，具体涉及一种辣椒抗白粉病indel标记及其在育种材料筛选鉴定中的应用。

背景技术：

1、辣椒(capsicum spp.)是茄科、辣椒属一年生或多年生草本植物，在世界上广泛种植，是世界范围内最为重要的蔬菜和辛辣香料作物之一。白粉病(leveillula taurica(lev.)arn.)是辣椒种植中最常见、危害最大的病害之一。植物在受到白粉菌侵染后，光合作用效率明显降低，其呼吸作用和蒸腾作用有所增强，生长所需营养物质积累减少而消耗增加，进而影响作物产量和品质。据报道，因落叶造成的损失高达75％，产量损失高达40％，此病害严重制约辣椒产业发展。

2、现有技术存在的问题：培育抗病品种通常被认为是控制这种病害最经济、有效和环境友好的方法。辣椒白粉病抗性一般为隐性，利用常规杂交育种选育辣椒抗白粉病品系需要多代回交和杂交，每代均要确保隐性抗性的渗入，而且病害发生需要在专门的病圃进行接种鉴定，这些不仅费时费工，而且成本高、周期长，大大增加了培育辣椒抗病品种的难度。而indel分子标记是在dna分子水平上进行检测，不受发育时期和外界环境等因子影响，在苗期就可以对抗感病单株进行筛选，不仅高效、快速，而且可以解决白粉病抗病表型鉴定困难的问题，极大缩短育种周期。现有技术中未见本技术所述高效的indel分子标记。

技术实现思路

1、鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种用于鉴别筛选辣椒抗白粉病育种材料的indel标记及应用。为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

2、1、辣椒抗白粉病indel分子标记capm8，该标记包括459bp的抗病序列，如序列表seq id no：3所示；428bp的感病序列，如序列表seq id no：4所示。该标记采用包括两条长度均为21bp的正向引物capm8-f和反向引物capm8-r进行鉴定；capm8-f如序列表seq idno：1所示，capm8-r如序列表seq id no：2所示。

3、2、辣椒抗白粉病indel分子标记capm8的获取方法，包括如下步骤：

4、(1)利用高抗材料c245与高感材料c110杂交(c245和c110均由甘肃农业大学园艺学院蔬菜遗传与分子育种实验室选育，申请人声明自申请日起免费向公众开放获取)，获得杂种一代f1，f1代植株自交得f2。

5、(2)对f2群体进行白粉病病情鉴定，最后选取21株白粉病抗性单株和22株感病单株，采集植株幼嫩叶片构建抗池rb和感池sb；

6、(3)分别提取双亲、抗池rb和感池sb叶片dna，委托欧易生物医学科技有限公司(上海)利用illumina hiseq2500进行高通量测序。

7、(4)通过预处理软件fastp(version:0.19.5)，对原始测序序列raw reads进行质量检测，去除含有带接头的、低质量的reads，得到clean reads。

8、(5)使用bwa(version:0.7.12)软件将两个亲本及极端混池clean reads与辣椒参考基因组(zunla-1)进行比较，以确定reads在参考基因组上的位置。

9、(6)基于样本与参考基因组的比对结果，使用samtools(version:1.4)软件的mpileup模块默认参数检测样本中的snp和indel位点。

10、(7)最后采用snp-index法计算与性状关联的候选区域。

11、snp-index是一个与snp位点测序深度相关的参数，该参数指子代某个位点含有突变亲本来源snp的reads数与测到该位点的总reads数的比值，大小范围为0-1。若该参数为0，代表所测到的reads都来自其中的一个亲本；该参数为1，代表所有reads都来自另一个亲本；该参数接近0.5，则代表此混池中snp来自两个亲本的频率相同。

12、将两个池观测到的snp都计算出snp-index，然后将两个池的snp-index值相减后得到δ(snp-index)，用δ(snp-index)作图，拟合线超出置信线的染色体区域为可能的表型连锁区域。最后将辣椒白粉病抗性区间定位在5号染色体上，区间大小约为4.55mb(chr05:7200302-11748632)。

13、(6)筛选该区域在亲本间纯合并且有差异的indel位点，并基于参考基因组提取该位点上下游500bp共1001bp的基因组序列，利用primer premier 5引物设计工具设计indel标记引物，最终对63个差异indel成功设计indel标记引物。

14、(7)用63对indel标记引物在亲本间和f1进行扩增检测，其中21对可以很好的在双亲及f1之间进行区分，具有多态性。以indel标记capm8在亲本间及f1的扩增为例，如附图1所示：m：dnamarker，a：抗病亲本c245基因型，b：感病亲本c110基因型，h：f1感病杂合基因型。

15、(8)利用在亲本间有多态性的21对indel标记在f2群体中进行多态性验证，发现capm8在f2群体中的基因型检测结果与白粉病抗、感表型鉴定结果一致性最高。确定indel标记capm8可作为鉴别筛选辣椒抗白粉病育种材料的候选分子标记。

16、3、辣椒抗白粉病indel分子标记capm8的应用，包括如下步骤：

17、(1)选取19份农艺性状优良的辣椒白粉病抗病自然群体单株，和32份辣椒白粉病感病自然群体单株。利用基因组dna提取试剂盒或ctab法提取每个单株基因组dna备用。

18、(2)利用capm8标记引物对步骤(1)中提取的51份dna样品进行扩增。pcr扩增体系为10μl，包括5μl 2×taq pcr mastermixⅱ，1μl的dna检测模板，0.5μl capm8-f，0.5μlcapm8-r，3μl ddh2o。pcr反应程序为:94℃预变性3min，94℃变性30sec；58℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环，72℃再延伸5min，4℃保存。

19、(3)pcr扩增产物利用12％(v/v)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)进行分离检测，pcr产物上样1μl，电压250v，电流120ma，1×tbe电泳缓冲液电泳90min。12％非变性(v/v)聚丙烯酰胺凝胶包括30％聚丙烯酰胺母液(丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺＝29：1)16ml，10×tbe 4ml，ddh2o 20ml，10％过硫酸铵(ap)400μl，temed 40μl。

20、(4)电泳结束后银染显色，具体操作步骤为：①将凝胶放入固定液中(50ml无水乙醇，3ml冰醋酸，447ml蒸馏水)在脱色摇床上固定15min。②将凝胶转入银染液中(0.1％的硝酸银500ml，1.2ml甲醛)，染色10min。③用500ml蒸馏水对凝胶进行漂洗(不超过30sec)。④将凝胶放入显影液(1.5％氢氧化钠500ml，5ml甲醛)中，显影至条带清晰。⑤将凝胶用蒸馏水再次漂洗后观察并拍照。

21、(5)通过51份自然群体的条带大小结合表型与附图1中的抗、感病条带进行比对(459bp条带为抗病，428bp或杂合条带h均为感病)，一致性达88.2％，达到了分子标记筛选的目的。

22、4.辣椒抗白粉病indel分子标记capm8在辣椒白粉病抗性鉴定中的应用，所述分子标记capm8包括459bp的抗病序列，如序列表seq id no：3所示；428bp的感病序列，如序列表seq id no：4所示。

23、有益效果：本发明的关键创新点是发掘了与辣椒白粉病抗性相关的indel位点，开发出一个用于鉴别筛选辣椒抗白粉病育种材料的indel标记引物对capm8。capm8包括两条长度均为21bp的正向引物capm8-f和反向引物capm8-r。利用capm8鉴别筛选辣椒抗白粉病育种材料，只需根据实例三中的扩增体系和扩增程序进行pcr扩增，结束后进行一次非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接通过电泳的条带大小(459bp条带为抗病，428bp或杂合条带h均为感病)即能筛选出抗、感病育种材料，检测效率达88.2％以上，操作简便，准确性高。