一种表达牛乳铁蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其构建方法与应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种高效表达牛乳铁蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、乳铁蛋白(lactoferrin，lf)，是转铁蛋白家族中的一种铁结合蛋白，分子量大小为约76-80kda，具有多样化生物活性。lf主要由各种哺乳动物的乳腺上皮细胞产生，包括人、牛、山羊、马、骆驼、狗和几种啮齿动物。根据来源的不同，可以分为人乳铁蛋白(humanlactoferrin，hlf)、牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin，blf)、羊乳铁蛋白(ovinelactoferrin，olf)等，应用上大都采用牛乳铁蛋白。

2、乳铁蛋白(lf)具有抗癌、抗病毒、抗菌、抗骨质疏松等广泛的生物学功能，多样化生物活性使得其在食品添加剂、医药、婴幼儿奶粉、宠物饲料、日化用品等行业都有良好的应用前景。乳铁蛋白最典型的应用方式是作为营养强化剂添加到婴幼儿配方奶粉、酸奶等乳制品中，也用作绿色饲料添加剂应用于动物的饲养，在家猪饲养的一般疾病防治上和饲料的喂养上发挥重要作用，是目前一种稀缺且昂贵的营养蛋白。目前，中国已成为全球第二大乳制品消费市场，也是全球最大的乳制品进口国。数据显示，2021年全年，中国累计进口各类乳制品389.73万吨，同比增长18.8％，其中，作为乳制品重要原辅料的干乳制品就达到了260.12万吨，同比增长17.7％。其中，我国乳铁蛋白进口依存度高达98％。除此之外，全球高纯度乳铁蛋白的生产技术，被外国垄断。2017-2020年，乳铁蛋白的价格从3000多上涨到30000元/公斤。2022年5月，飞鹤乳业成功获批乳铁蛋白生产许可，我国乳品行业第一条乳铁蛋白自动化生产线正式投产。传统提取法效率低，需要大量奶源，每10000升，仅可获得仅1公斤的纯化乳铁蛋白。乳铁蛋白活性和稳定性随牛奶的来源而异，副产物多、设备投入大、提取工艺复杂、工艺不成熟、仅有少数企业能够达到乳铁蛋白95％以上的纯度，普遍为80％。且作为应用于人体的异源蛋白，直接从牛乳中提取的乳铁蛋白可能引起一定的抗原反应。因此急需探寻新的高效制备lf的方法。

3、随着基因工程技术的发展，利用基因工程菌在反应器中大量生产乳铁蛋白已经成为研究热点，也为国产化乳铁蛋白提供一个新思路。目前已经有一些尝试，利用基因工程手段结合分子生物学的方法，对于lf在不同的微生物体系，植物体系和动物中进行异源表达，旨在寻找一条更快捷、高效、环保的制备lf的方法。大多数的研究都能成功表达，但表达量普遍不高。如何获得大量具有生物活性的乳铁蛋白一直困扰着研究人员。

4、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)是一种革兰氏阳性细菌，可以高效分泌多种蛋白及代谢产物，并且不会产生内毒素，是一种安全的(generallyrecongnized as safe,gras)食品级微生物系统，且其遗传背景清晰，操作过程简单，分泌表达能力较强，经常作为优良的底盘细胞被广泛应用于医药卫生以及食品等领域，是原核表达系统中分泌表达外源蛋白的理想宿主。且目前还未有报道乳铁蛋白在解淀粉芽孢杆菌中的表达。利用解淀粉芽孢杆菌作为牛乳铁蛋白的表达宿主，为利用基因工程菌生产乳铁蛋白提供一种新的思路。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高效表达牛乳铁蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其构建方法与应用。

2、本发明思路为：本发明采用解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)与组成型表达载体pma5进行牛乳铁蛋白的表达。通过筛选常用的信号肽促进乳铁蛋白的胞外分泌表达。进一步通过发酵培养基的优化和发酵体系的放大，有效的提高乳铁蛋白的表达量。

3、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

4、一种表达牛乳铁蛋白的重组解淀粉芽孢杆菌，以解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciens为宿主，异源表达牛乳铁蛋白编码基因blf得到的。

5、其中，所述的重组解淀粉芽孢杆菌还导入了信号肽。

6、其中，所述的解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciens为解淀粉芽孢杆菌nfδse，是食品安全级宿主解淀粉芽孢杆菌nf的改造菌株，即在解淀粉芽孢杆菌nf的基础上敲除编码胞外多糖合成基因簇epsa-o、脂多糖合成基因lps和果聚糖酶基因sacb得到的。(解淀粉芽孢杆菌nfδse的详细信息已公开在文章design and construction of a bacillusamyloliquefaciens cell factory for hyaluronic acid synthesis from jerusalemartichoke inulin中。)

7、其中，所述的牛乳铁蛋白编码基因blf，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

8、其中，所述的信号肽为dacb、amye和sacb中的任意一种，优选信号肽为amye。

9、具体的，所述的dacb信号肽的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述的amye信号肽的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述的sacb信号肽的核苷酸序列如seq id no.4所示。

10、其中，所述的重组解淀粉芽孢杆菌，其表达载体为pma5(购于biovector ntcc质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心)。

11、一种表达牛乳铁蛋白的重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

12、(1)将牛乳铁蛋白编码基因blf克隆到表达载体pma5中，并验证，得到重组质粒pma5-blf；

13、(2)以步骤(1)的重组质粒pma5-blf为模板，pcr扩增信号肽，获得各信号肽基因片段，将获得的各信号肽基因片段分别克隆到表达载体pma5中，转化后经pcr验证，分别获得重组质粒pma5-dacb-blf、pma5-amye-blf、pma5-sacb-blf；

14、(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化入宿主解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciens感受态细胞中，构建重组解淀粉芽孢杆菌。

15、其中，所述的宿主解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciens还可以为枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，具体为枯草芽孢杆菌168。优选的宿主为解淀粉芽孢杆菌nfδse。

16、上述重组解淀粉芽孢杆菌在发酵制备乳铁蛋白中的应用也在本发明所保护的范围之内。

17、其中，所述的发酵，其发酵条件为：发酵温度为28-37℃；转速为300r/min；发酵时间为24-28h。

18、优选的，发酵条件为：发酵温度为32℃；转速为300r/min；发酵时间为36h。

19、其中，所述的发酵，其发酵培养基配方为：碳源20-40g/l，蛋白胨12g/l，k2hpo412.5g/l，kh2po4 2.3g/l，甘油4ml，(nh4)2fe(so4)2 0-1.5mg/l。

20、其中，所述的碳源为葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖、玉米淀粉中的任意一种或几种的组合，优选葡萄糖。

21、优选的，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖40g/l，蛋白胨12g/l，k2hpo4 12.5g/l，kh2po4 2.3g/l，甘油4ml，(nh4)2fe(so4)2 1.2mg/l。

22、有益效果：

23、(1)本发明首次以解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌作为牛乳铁蛋白的表达宿主，为利用基因工程菌生产乳铁蛋白提供一种新的思路。

24、(2)筛选了常用的信号肽促进乳铁蛋白的胞外分泌表达。发酵实验发现，信号肽能有效的促进乳铁蛋白的胞外表达。其中amye信号肽对应的重组菌株的乳铁蛋白的分泌得到明显的改善，胞外乳铁蛋白表达量高达39.4mg/l。

25、(3)通过对发酵培养基成分进行优化和发酵体系的放大，能有效的提高乳铁蛋白的表达量，胞外乳铁蛋白表达量为105mg/l。