抑制TGFβ基因表达的siRNA、装载siRNA的纳米粒子及其用途

本发明属于基因治疗领域，主要涉及抑制tgfβ基因表达的sirna药物以及递送抑制tgfβ基因表达的sirna的纳米粒子。

背景技术：

1、在过去的几十年中，癌症研究主要集中在恶性细胞和相关基因调控上，而最近，肿瘤微环境(tme)的概念已被广泛接受。肿瘤与其微环境之间的动态相互作用被认为对致癌作用具有显著影响，同时也很大程度影响了肿瘤发生发展的进程以及。除肿瘤细胞外，tme还由多种非恶性细胞组成，如成纤维细胞、间充质干细胞、血淋巴内皮细胞和大量浸润性白细胞。

2、近年来，越来越多的研究显示，肿瘤细胞处于一种免疫耐受状态，除了pd-l1、ctla-4免疫检查点外，转化生长因子-β(transforming growth factorβ,tgfβ)也是一个促进肿瘤耐受的基因。tgfβ是免疫稳态和免疫耐受的重要促进因子，抑制免疫系统多种成分的扩张和功能。在肿瘤微环境中，tgfβ对免疫抑制也起着重要作用，能调节许多类型免疫细胞的产生和功能。它通过直接促进treg细胞的扩张，抑制效应t细胞和抗原递呈树突状细胞(dc细胞)的产生和功能，控制适应性免疫。特别是当肿瘤发生到后期，很多肿瘤细胞已经对tgfβ的作用产生了一定耐受。而大多数肿瘤细胞都会通过自分泌或旁分泌产生tgfβ，导致肿瘤组织中的tgfβ浓度高过生理水平。这时tgfβ往往会促使肿瘤细胞发生emt，促进肿瘤的浸润和转移，参与肿瘤免疫逃逸，以及促进血管的生产发挥促癌作用。因此，tgfβ有作为肿瘤治疗靶点的潜力。

3、小核酸药物通过反义原理靶向rna可使特定疾病基因沉默，达到治疗目的，作为一种治疗策略，具有高特异性、高效性、长效性等优势，大大扩展了可用于治疗的靶点的数量和类型，而高效的递送系统是小核酸药物研发和运用的关键。目前，小核酸药物在实际应用过程中也效果往往不及预期，向患者注射小核酸药物后，药物如何在体内存留足够长的时间，如何让治疗性的小核酸精准进入靶向细胞发挥治疗功能，并最大程度的避免误伤正常细胞等方面还面临很大的挑战。小核酸药物效果不及预期还可能是由于以下方面的差异：(1)sirna靶点选择及序列设计的挑战，如特异性、有效浓度、沉默效率、脱靶效应等；(2)药物输送方式(路径、载体、频率、效率)；(3)肿瘤细胞内的药物的区域化分布；(4)癌症进展阶段；(5)患者免疫系统的能力区别；(6)获得性耐药。肿瘤异质性、肿瘤微环境的变化、药物失活、肿瘤细胞药物吸收减少或药物释放增加、肿瘤细胞存活途径的激活和表观遗传变化等等方面也都有可能影响小核酸药物的使用情况。此外，小核酸药物尤其是rnai药物到达作用位点需要穿过胞膜作用于胞浆或核内的mrna，递送难度大，尽管化学修饰能够一定程度解决稳定性和免疫原性的问题，但如果不能进入细胞实现胞吞，小核酸药物依然不能发挥药物作用。dp7多肽(vqwrirvavirk)是用计算机辅助设计新型抗菌肽的筛选方法，通过对模板抗菌肽hh2替换了2个氨基酸得到的具有更高的细菌识别特异性与更强的抗菌活性的抗菌肽。抗菌肽纳米化可以使其获得较好稳定性及减少毒性，这为抗菌肽的应用提供一个新研究方向。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是为小核酸抗肿瘤药物提供一种新的有效选择。

2、为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种抑制tgfβ基因表达的sirna。该sirna的序列如下：

3、正义链(seq id no.1):5’-cggacuacuaugcuaaagatt-3’

4、反义链(seq id no.2):5’-ucuuuagcauaguaguccgtt-3’。

5、本发明还提供了上述抑制tgf-β基因表达的sirna在制备抗肿瘤药物中的用途。进一步的，所述的肿瘤为黑色素瘤或者结肠癌。

6、本发明还提供了一种装载了上述的sirna的纳米粒子。该纳米粒子是由疏水化修饰的多肽装载上述的抑制tgfβ基因表达的sirna制备而成；所述多肽的序列为vqwrirvavirk，所述的疏水化修饰为在多肽的氮末端偶联疏水片段。

7、其中，上述装载sirna的纳米粒子中所述的多肽vqwrirvavirk(seq id no.3)碳端酰胺化修饰为vqwrirvavirk-nh2。

8、其中，上述疏水片段为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或peg或peg衍生物；其中，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物；或者所述饱和直链脂肪酸为c6-c20中的至少一种。

9、其中，上述的甾醇类化合物为丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种；或者所述的peg衍生物为1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇中的至少一种。

10、其中，上述多肽的氮端与疏水片段偶联的方式为通过疏水片段上的-co-oh与多肽上的-nh2酰胺化反应生成。优选的，所述疏水化修饰的多肽结构为：

11、

12、所述的多肽结构中所述的r为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或peg衍生物

13、进一步的，上述多肽结构中的r为：

14、

15、

16、中的至少一种。

17、其中，上述装载sirna的纳米粒子中所述的疏水化修饰多肽和小核酸按质量比3～6︰1作为原料制备而成。优选的，上述疏水化修饰多肽和小核酸按质量比为5︰1。

18、进一步的，上述装载sirna的纳米粒子是由疏水化修饰多肽与sirna共孵育制得。

19、其中，上述装载sirna的纳米粒子是由疏水化修饰多肽与sirna在水中或液态培养基中共孵育5～15min而得。所述液态培养基为rpmi 1640、dmem双无培养基或optim培养基中的至少一种。

20、具体的，本发明方法包括以下步骤：

21、a、称取适量dp7-c粉末，加入灭菌水溶解，自发形成胶束

22、b、将tgfβ靶点基因的sirna按照质量比为(dp7-c:sirna或aso＝3:1～5:1)室温孵育15-20min，即得到dp7-c/sirna复合物。

23、本发明还提供了上述的抑制tgfβ基因表达的sirna或上述的装载sirna的纳米粒子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

24、进一步的，所述的肿瘤为肺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤或者结肠癌中的至少一种。

25、本发明还提供了一种抗肿瘤药物，是由上述的抑制tgfβ基因表达的sirna或上述的装载sirna的纳米粒子添加药学上可接受的成分制备而成。进一步的上述药物还可以含有药学上可以接受的辅助性成分。

26、其中，上述的治疗肿瘤的药物为原位瘤内注射治疗药物。

27、本发明的有益效果在于：本发明提供了一个效果很好的，针对tgfβ基因的sirna分子。本发明tgfβsirna能高效抑制tgfβ基因的表达，mrna水平显著下调，可达70％以上，蛋白表达得到明显抑制，抑制率可达到90％，有显著的抑制肿瘤的功能。本发明还进一步地使用了抗菌肽衍生物dp7-c作为sirna递送载体。本发明还针对tgfβ基因提供了基于dp7-c的小核酸递送系统，原位递送tgfβsirna可以用于原位皮下瘤等肿瘤的治疗。本发明涉及到的dp7-c胶束除了高效的sirna传输能力，其在体内外均表现出较高的安全性，是良好的基因传输载体。本发明为小核酸药物用于肿瘤治疗的新药研发提供了一种新的选择。